[发明专利]一种用灵发素诱导甘蔗胚状体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用灵发素诱导甘蔗胚状体的方法。

技术背景

“胚状体”也称“体细胞胚胎”，简称“体胚”，是获得再生植株和制造人工种子的重要材料，也是从解剖学及内在生理生化机制方面研究细胞分化、器官建成和个体发育的重要材料，因此对胚状体的研究已成为近代植物生物学界的一个热门领域。国内外对甘蔗胚状体的研究也有不少报道。但是，目前使用的基本培养基基本局限于MS和N₆两种，而用于诱导胚状体发生的生长调节剂则无一例外地都是人工合成的，具有一定毒性和残留的苯类衍生物2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)。而且单用2，4-D时，胚状体发生率仅有百分之十几。也有人将2，4-D再复配BA(N⁶-BA，N⁶-苄基腺嘌呤)或水解乳蛋白，以求提高胚状体发生率，不过也只能达到百分之三十至五十。灵发素(Lingfasu，LFS，代号PGR-08)作为一种新型的，生物源的植物生长调节剂，无毒害，无残留。在被公认为难以组培的传统中药材三七胚状体的研究中，用LFS成功地诱导茎切段、叶柄和叶片等不同器官都获得了大量胚状体(许鸿源等，中药材，2004，27(10)：711-712；中国中药杂志，2007，32(6)：481-483)。但是，尚未检索到LFS诱导甘蔗胚状体的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用灵发素诱导甘蔗胚状体的方法，它能够诱导甘蔗胚状体。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：一种用灵发素诱导甘蔗胚状体的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1、将蔗株梢部用70％酒精消毒外表，将离生长点0.01-4.0cm幼嫩叶片切成为0.3-0.5cm方块，

2、将上述方块接在MS+LFS0.6～1.0mg/L固体培养基上进行全天24小时无光照的暗培养，8-12天后获得愈伤组织；

3、将上述愈伤组织在不更换培养基条件下每天进行每天光照时间10～12小时，光强2000～2500LX的光、暗交替培养，7-10天后得到形态各异的胚状体，

4、将上述胚状体转到MS+LFS0.6～1.0mg/L新鲜培养基上培养，每20-30天更换一次新鲜培养基，得到黄色的胚状体。

本发明的有益效果：

应用本发明，可诱导产生大量结构松散、颗粒状、颜色为米黄色的优质甘蔗胚状体。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

表1中实施例1为采用MS+2，4-D 2.0mg·L^-1诱导甘蔗胚状体的对比例。

实施例2为本发明所述一种用灵发素诱导甘蔗胚状体的方法，包括如下步骤：

1.从甘蔗田选择茎径较粗大且无明显病虫为害症状的蔗株梢部，用70％酒精消毒外表，在超净工作台上，去除梢部老叶，将离生长点0.01-4.0cm幼嫩叶片，切成大小为0.3-0.5cm方块；

2.将上述方块接在MS+LFS0.6～1.0mg/L固体培养基上进行暗培养，全天24小时无光照，8-12天后获得愈伤组织；

3.将上述2的材料在不更换新培养基条件下，每天进行光、暗交替培养，每天光照时间10～12小时，光强2000～2500LX，7-10天后形态各异的胚状体形成，发生率≥85％。发生率＝发生胚状体的幼叶切片数/接种的幼叶切片数×100％。

4.将上述3的材料转到MS+LFS0.6～1.0mg/L新鲜培养基上培养，每20-30天更换一次新鲜培养基，大面积形成结构松散、颗粒状、颜色米为黄色的胚状体。

表1两种不同培养基的实验结果

注：甘蔗品种为新台糖22号。

从表1中实验数据可以看出，在相同接种切片数情况下，采用本发明得到的出胚状体切片数比传统培养基得到的出胚状体切片数多47片，胚状体发生率高达93.3％。