[发明专利]草鱼胸腺素β11基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学中的基因克隆领域，尤其涉及草鱼胸腺素β₁₁基因的核苷酸及氨基酸序列。 

背景技术

β-胸腺素(Thymosin β，Tβ)是一类结功能多样的小肽分子，分子量大小为5KD左右，等电点介于5～7之间，是细胞中主要的肌动蛋白单体结合蛋白，防止肌动蛋白单体聚合形成肌动蛋白纤维，维持G-肌动蛋白和F-肌动蛋白的动态平衡，对细胞骨架的稳定起至关重要的作用。胸腺素β还通过调节末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)的活性促进T细胞的分化成熟。此外，胸腺素β还具有缓解炎症、抑制细胞凋亡的功能，在肿瘤的发生中起重要作用。 

目前NCBI上只能查到较少种类鱼类的Tβ的全长cDNA，而在淡水经济鲤科鱼类中克隆到β-胸腺素(Thymosin β，Tβ)尚属首次。 

目前β-胸腺素在草鱼基因研究上还属空白。本基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究草鱼病害的防治提供新的思路。 

发明内容

本发明的目的是以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中β-胸腺素EST序列为模版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼β-胸腺素基因的全表达序列。 

上述目地是通过以下技术方案来实现的： 

取出新鲜草鱼肠道组织，采用TRIzol(Invitrogen Corporation)一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator(Qenequant)检测总RNA质量。 

本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到β-胸腺素EST序列，经测序比对后发现该EST序列具有β-胸腺素的完整3’端，欠缺cDNA序列的5’端。利用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的5端进行扩增。 

根据已知EST序列设计外侧和内侧两个特异引物： 

5端特异引物1：5’-GGCAATGCAGGGAAGGGAG-3’ 

5端特异引物2：5’-CGCCTGCTTCTCCTGTTCAATG-3’ 

通用引物： 

Long：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ 

Short：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ 

接头引物：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’ 

5端核心引物：5.’-(T)25V N-3’(N＝A，C，G，or T；V＝A，G.，or C) 

以接头引物和5端核心引物反转录合成的第一链cDNA为模版进行PCR反应，上游引物使用通用引物，下游引物使用5端特异引物1。PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后用通用引物和5端特异引物2进行PCR验证。将验证后的序列片段连接到pMD18-T质粒，转入E.Coli JM109菌株，经质粒酶切验证后用M13通用引物测序。扩增得到片段大小为170bp。 

再根据5端扩增片段和已知EST序列拼接，对全序列进行调整后获得了完整的草鱼β-胸腺素基因序列，既目的基因。 

草鱼β-胸腺素基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究草鱼病害的防治提供新的思路。 

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明的内容完全不局限于此。 

1.总RNA的提取 

挑选实验材料——健康雌性草鱼，体长570mm，约1.5冬龄(18个月)，2.4kg。取出新鲜草鱼肠道组织，液氮迅速冷冻后保存于-80℃冰箱备用。采用TRIzol(InvitrogenCorporation)一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator(Qenequant)检测总RNA质量。 

2.cDNA第一链的合成 

取草鱼肠道细胞总RNA 5ug与反转录引物(5端核心引物和接头引物)各1ul(12uM)混合，70℃加热2分钟，立即放置冰上，然后加入5x buffer，10mM dNTP混合液，20mM DTT，M-MLV反转录酶，反应体系为10UL。反应过程为42℃1小时30分钟，之后加入90ul TE buffer(PH8.0)，72℃加热7分钟。最后得到100ul草鱼肠道细胞cDNA模板，放入-20℃保存备用。 

3.引物设计依据和合成方法