[发明专利]用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的引物组及检测体系

说明书

技术领域

本发明涉及一种用环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测脊髓灰质炎病毒的引物组、检测体系、检测方法及用途。

背景技术

脊髓灰质炎(脊灰)病毒是肠道病毒的一种，常侵犯中枢神经系统，导致肢体松弛性麻痹，多见于儿童，故又名小儿麻痹症。该病流行于全世界，严重威胁着人类的健康。1988年世界卫生大会通过了全球2000年消灭脊灰的目标，脊灰病毒野毒株的感染报道明显下降，但由疫苗衍生的脊灰病毒同时成为一种致命的流通形式。因此，加强对于脊灰病毒的检测，建立一种快速、准确的检测方法，有着十分重要的意义。

肠道病毒的传统检测方法为病毒分离培养，然后进行血清中和试验定型分类，此法繁琐、耗时、费力，虽然多数培养结果可在1周内得到，但中和试验却十分费时，昂贵，甚至有时无法定型。PCR方法具有快速、敏感性强、特异性高等诸多优点，已应用于脊髓灰质炎的检测。但PCR方法存在对检测设备要求高，结果判断不直观等问题，限制其在基层单位的应用。2000年，Notomi T等发明的LAMP技术缩短了扩增时间，提高了扩增效率，并且具有更高的灵敏度、特异性，降低了仪器设备及检测条件的要求，被公认为具有较强实用性的分子检测技术。目前，LAMP技术已经成功应用于多种病毒的检测，如SARS冠状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒等。本研究建立了一种专门针对脊髓灰质炎病毒基因的LAMP检测方法，

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供了一种用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的引物组；

本发明的第二个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的检测体系。

本发明的第三个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的方法。

本发明的第四个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的检测体系的用途。

本发明的技术方案概述如下：

用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的引物组，它由序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成。

用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的检测体系，该体系由下述原料组成：

10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；

25mmol/L的Mg²⁺ 3μL-7μL；

5mol/L的Betaine 1μL-6μL；

50mmol/L的dNTP 0.6μL-1μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；

100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；

100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；

8U/μL的Bst酶1μL；

加超纯水至总体积为20μL。

用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的方法，它包括下述步骤：

(1)提取待检测样品中的病毒RNA并逆转录为cDNA；(2)取5μL所述cDNA加入到20μL的用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的检测体系中，10000转/分钟，离心30秒；(3)加入20μL矿物油，于60℃恒温中进行环介导恒温扩增技术扩增1-1.5小时；(4)取出反应管，加入8μL-10μL SYBR Green Ⅰ型核酸染料，若反应液变成绿色，则说明待测样品中存在脊髓灰质炎病毒，若为桔黄色，则说明待测样品中不存在脊髓灰质炎病毒，所述用环介导恒温扩增技术检测脊髓灰质炎病毒的检测体系由下述原料组成：

10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；

25mmol/L的Mg²⁺ 3μL-7μL；

5mol/L的Betaine 1μL-6μL；

50mmol/L的dNTP 0.6μL-1μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；

100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；

100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；