[发明专利]黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法

权利要求书

1.黑素细胞生物活性检测方法，所述方法包括：取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞，进行传代培养，传代培养过程中进行下述参数评测：

(1)黑素细胞分裂时间DOT计算：每次接种和传代时计数黑素细胞数量，计算获得传代时细胞生长倍数P，根据细胞生长倍数P和生长时间T，按公式计算细胞黑素分裂时间DOT＝0.3T/logP，单位为日；

(2)黑素含量M计算：用二甲基亚砜溶解已知浓度的黑色素，在分光度计475nm处测吸光度A₀，以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线；在黑素细胞接种和传代时，收集定量黑素细胞离心，加入1mol/l NaOH在37℃水浴溶解细胞30分钟后，在分光度计475nm处测细胞吸光度A，根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M，单位ng/cell；

(3)黑素制造量MP计算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP为黑素细胞制造量，单位ng/cell/24hr；M₁为接种时细胞黑素含量，单位ng/cell；M₂为传代时细胞黑素含量，单位ng/cell；P为细胞增长倍数；D为细胞分裂时间DOT，单位日；

(4)结果判断：若传代细胞的DOT值＜4.5，且M、MP满足：0.15＜M＜0.30，MP＜0.10，则判定该传代细胞处于开始或生长阶段，适宜进行自体黑素细胞移植。

2.一种黑素细胞个体化培养方法，所述方法包括：

(一)取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞，于Hu16培养基中进行传代培养，传代培养过程中进行下述参数评测：

(1)黑素细胞分裂时间DOT计算：每次接种和传代时计数黑素细胞数量，计算获得传代时细胞生长倍数P，根据细胞生长倍数P和生长时间T，按公式计算细胞黑素分裂时间DOT＝0.3T/logP，单位为日；

(2)黑素含量M计算：用二甲基亚砜溶解已知浓度的黑色素，在分光度计475nm处测吸光度A₀，以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线；在黑素细胞接种和传代时，收集定量黑素细胞离心，加入1mol/l NaOH在37℃水浴溶解细胞30分钟后，在分光度计475nm处测细胞吸光度A，根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M，单位ng/cell；

(3)黑素制造量MP计算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP为黑素细胞制造量，单位ng/cell/24hr；M₁为接种时细胞黑素含量，单位ng/cell；M₂为传代时细胞黑素含量，单位ng/cell；P为细胞增长倍数；D为细胞分裂时间DOT，单位日；

所述Hu16培养基终浓度组成如下：

bFGF 25ng/ml，CT 10ng/ml，IBMX 20ug/ml，胎牛血清10％，溶剂为F12基础培养基；

(二)根据传代细胞各参数评测结果，对培养基组分进行调整：

1)、若传代细胞的DOT值＞3.5，M值降低至M＜0.15，细胞的树突无变化，则将Hu16培养基中胎牛血清浓度增加到15％～20％；

2)、若传代细胞的DOT值＞3.5，M值升高至M＞0.3，细胞的树突无变化，则将Hu16培养基中bFGF浓度增加到40～80ng/ml；

3)、若传代细胞的DOT值＞3.5，且细胞的树突减少至＜3，则将Hu16培养基中的IBMX浓度增加到30～60ug/ml、CT浓度增加到20～40ng/ml。