[发明专利]一种发酵生产亚硝酸还原酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵生产亚硝酸还原酶的方法。

背景技术

由于环境中硝酸盐、亚硝酸盐的大量富集及食品加工中添加化学合成的亚硝酸盐，使农产品原料、水源、加工食品及饲料中有大量亚硝酸盐残留。亚硝酸盐是一种对人体有害的物质，它不仅使人直接中毒、致死，而且是致癌物亚硝胺的前体。如何安全、快速地降解亚硝酸盐成为保护人体健康急需解决的问题。现在世界各国都在致力于亚硝酸盐替代物以及降低其残留研究。但是至今还未找到一种理想的、能够完全替代亚硝酸盐的物质，世界各国现在都在致力于研究减少肉制品中亚硝酸盐残留量的措施。利用微生物发酵产生的亚硝酸还原酶，可以很好的降解亚硝酸盐，减少其残留，在肉制品加工有很广泛的应用前景。

传统研究认为，进行亚硝酸盐降解成NO的细菌都是兼性厌氧微生物，因为只有在无氧条件下，才能诱导出NiR。然而，近几年人们不断地发现好氧条件下发生也会发生亚硝酸盐的降解，如Giovanni Vigliotta等研究发现一种酵母Debaryomyceshansenii TOB-Y7能够在纯化学合成培养基中、在微需氧条件下利用亚硝酸盐作为唯一氮源，降解亚硝酸盐的能力伴随YNI1基因的表达，该基因为编码同化NAD(P)H：NiR，电子传递体的添加有助于NiR的产生。由于好氧条件下微生物体内同时存在呼吸链和亚硝酸盐还原双重的电子传递系统，目前外界环境的变化对NiR的生产及电子传递的影响还不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产亚硝酸还原酶的方法。

本发明提供的发酵生产亚硝酸还原酶的方法，包括如下步骤：发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627，得到亚硝酸还原酶。

所述发酵中包括添加连二亚硫酸钠的步骤。

所述添加连二亚硫酸钠的时机为：从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627接种在所述发酵中使用的发酵培养基中时计起，培养8h-18h后，添加所述连二亚硫酸钠；具体为培养8h、9h、12h、14h、16h或18h后，添加所述连二亚硫酸钠；所述添加连二亚硫酸钠的量为：每1L所述发酵培养基中加入(0.005-0.05)mol所述连二亚硫酸钠，具体为0.005mol、0.01mol、0.02mol或0.05mol。

所述发酵的方式为以下A或B：

A：1)从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCC No.1627接种在所述发酵培养基中时计起，先持续振荡培养(14-18)h，具体为14h、16h或18h；

2)在步骤1的基础上添加所述连二亚硫酸钠，继续持续振荡培养(2-6)h，具体为2h、4h或6h；

B：1)从所述将巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627接种在发酵培养基中时计起，先间隔性振荡培养8-12h，具体为8h、9h或12h，再持续振荡培养(2-8)h，具体为2h、6h或8h；

2)在步骤1)的基础上添加所述连二亚硫酸钠，继续持续振荡培养(4-6)h，具体为4h、5h或6h。

所述发酵的方式还可以为：从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627接种在发酵培养基中时计起，先间隔性振荡培养(8-12)h，具体为8h、10h或12h，再持续振荡培养(8-12)h，具体为8h、10h或12h。

所述间隔性振荡培养的方式为：振荡培养，且每隔(1-4)h静置(5-15)min，具体为每隔1h、2h、3h或4h静置5min、10min或15min；

所述持续振荡培养中和所述间隔性振荡培养中的振荡的速度均为160r/min，旋转半径为12mm；

所述间隔性振荡培养和所述持续振荡培养的温度均为30℃。

所述发酵培养基为将15g葡萄糖、1.5g牛肉膏、1.5g蛋白胨、1.35g磷酸氢二钾、0.7g磷酸二氢钾、1g氯化钠、0.138g亚硝酸钠、0.1g MgSO₄·7H₂O、0.01g MnSO₄·H₂O和0.02g CaCl₂·2H₂O溶于水中，用水补至1L；

所述发酵培养基的pH值为7.0。