[发明专利]用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针及其方法

说明书

技术领域

本发明属于植物检疫技术领域，涉及用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，另外本发明还涉及用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测方法。

背景技术

梨衰退植原体属于国家质量监督检验检疫总局新发布的《进境植物检疫性有害生物名录》中列出的果树检疫性植原体之一，是对我国果树产业有高风险性的病害。长期以来，梨衰退植原体的检测采用免疫电镜法，该检测方法繁杂、检测灵敏度低，这些问题一直困扰着检疫人员，因此研发一套快速、准确，操作简便的方法，才能满足检疫工作的需求。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，能特异性的检测出梨衰退植原体，灵敏度达0.5pg????l^-1，具有用于梨衰退植原体检测的功能。另外本发明还提供一种用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测方法，方法操作简单，易于掌握，检测精度高，可广泛应用于实验室日常检测工作。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，含有一条特异性循环探针（LST Probe）和一对引物（LST Primer）：

（1）探针（LST Probe）：5’-(FAM) ATTCTGACTGTA-3’

（2）引物（LST Primer-F）：5’-ACTCTGACCGAGCAACGCC -3’

         （LST Primer-R）：5’- GATAACGCTTGCCCCCTATG -3’

其中：方框内为RNA碱基。

所述用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，其合成方法是：首先在基因库（Genebank）中搜集全部植原体及有代表性细菌的16srDNA核酸序列，采用DNASTAR软件进行序列比对，找出梨衰退植原体与其他植原体的基因差异位点，设计出实时荧光PCR循环（Cycling）探针（LST Probe）及引物（LST Primer-F、LST Primer-R），并于生物公司合成。

所述用于梨衰退植原体实时荧光PCR检测的引物、探针，其LST Probe特异性验证：将梨衰退植原体、2种以上检疫性植原体及2种以上不同属的细菌DNA作为模板进行LST Probe特异性验证，PCR反应体系：

2×Cycleave   PCR Reaction Mix12.5 μlCycleave Primer Mix（10uM）1 μlCycleave Probe（3uM）1 μlDNA1 μldH₂O9.5 μlTotal25 μl

PCR反应条件：预变性95℃ 10sec；变性95℃ 5sec，退火55℃ 10sec，延伸72℃ 15sec，45cycles；LST Probe特异性验证通过后，即表明该引物及探针可应用于杏褪绿卷叶植原体的检测。