[发明专利]使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微方法和装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光显微方法及装置。

背景技术

自从17世纪荷兰科学家Leeuwenhoek发明了首台光学显微镜并用它观察微生物以来，光学显微技术以其速度快、非接触、可探测样品内部等优点，一直是研究活细胞生命现象的主流方法。光学显微技术根据探测模式可分为两大类：点扫描成像技术和宽场成像技术。以激光共聚焦荧光显微为代表的点扫描成像技术用高度聚焦的激光束对样品逐点扫描成像，荧光信号经过探测针孔滤波后被光电倍增管探测收集，通过软件可以重新组合生成一个三维图像。在扫描过程中，探测针孔会挡住离焦部分的荧光信号而只让焦点处的荧光信号通过并被探测器接收，大部分的荧光信号不会被探测但是依然会对样品产生漂白作用(这种情况在3D成像时尤为明显)。这样一来，逐点扫描完整个样品有可能会产生严重的光漂白效应，而且有可能对活体生物组织带来损伤。宽场成像技术就是“面成像”，采用面阵图像传感器(如CCD相机)，可以在一个时间点获得一幅完整的二维图像，与点扫描成像比，宽场成像技术具有速度快、光漂白效应弱，图像灰度级高等优点。但是由于受样品离焦部分的干扰，普通的宽场成像技术不具有三维层析成像能力。1997年，牛沣大学Neil等人提出一种结构照明显微(Structured Illumination Microscopy，SIM)技术，极大地增强了宽场显微镜的轴向分辨率，具有三维层析成像能力。其原理是：在非相干成像过程中，只有图像的零频信号随着离焦而保持不变，其它频率信号会随着离焦而迅速衰减。因此在实验中可以使用具有固定空间频率的结构光场激发样品，这样一来，只有焦平面处样品才可以清晰成像，离焦时结构照明光场会迅速衰减。缺点是采集到的图像将不可避免地带有结构光场的条纹图案，但该条纹图案可以通过图像处理算法而被消除。通过每次平移结构照明光场三分之一个条纹周期，使CCD曝光得到三幅子图像I₀，I₁₂₀，I₂₄₀，将三幅子图像通过公式

Ix(y,z)=[(I0-I120)2+(I120-I240)2+(I240-I0)2]/2---(1)]]>

计算，最后可以得到焦平面处没有条纹背景的层析图像I_x(y，z)。

普通结构照明显微技术通常使用非相干光源照明一个一维正弦光栅，用同一个显微物镜将光栅微缩成像在样品上并且同时采集图像，通过电控平移台平移光栅可以移动作用在样品上的光栅相位，同时控制CCD曝光得到三幅子图像I₀，I₁₂₀，I₂₄₀，再通过公式(1)的运算，得到样品的层析图。但是当待观测样品比较厚时，普通的结构照明显微光场将会产生比较大的畸变，为后期的图像处理带来困难。另外普通结构照明显微技术使用光栅微缩成像产生结构照明光，振幅型光栅的透过率理论上最大只有50％，因此光能利用率不高。

发明内容