[发明专利]鸭疫里默氏菌血清1型、2型、4型三价油乳剂灭活疫苗

说明书

1.技术领域  本发明涉及一种鸭疫里默氏菌三价油乳剂灭活的制备方法及其在预防由鸭疫里默氏菌引起的各种病症中的应用。

2.背景技术  鸭疫里默氏菌(Rimerella-anatipestifer，RA)是鸭传染性浆膜炎病的病原体，它侵入机体可引起以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎为特征的全身性疾病。鸭疫里默氏菌是一种非溶血性，非运动性、革兰氏阴性细小杆菌。随着世界养鸭业的发展，该病已成为全球范围内影响养鸭业的一种重要细菌性疾病。

在鸭群的养殖中，做好平时的预防工作尤为重要。至今，我国几乎所有养鸭地区都报道了本病的发生。近年来由于养鸭数量增大，鸭疫里默氏菌病的发生呈上升趋势。研究表明各地区都有RA优势血清型的存在，而针对优势血清型研制疫苗是一种有效的防治手段。大量研究证实了免疫商品疫苗成功的案例，目前使用的疫苗主要是灭活的单价及二价灭活疫苗，通过接种这些疫苗可以有效控制该疫病的发生。但是，RA血清型众多且没有交叉保护作用，而目前在RA感染的鸭场中血清型大多呈多样化分布这都直接影响了疫苗效果的发挥。血清型复杂多变，在不同时期，不同地区流行的血清型存在着差异，加强血清型的监测工作并研制有效的多价苗是目前解决该病的关键。所以，研制一种多价血清型且含有独特菌株的商品疫苗是非常关键的。

3.发明内容  现有的鸭疫里默氏菌灭活苗多为单价及二价灭活苗，分别针对血清1型、血清2型。本发明提供一种三价的灭活疫苗，同时预防当前我国鸭疫里默氏菌流行菌株的主要血清型即血清1型、2型和4型引起的疾病。

4.技术方案  本发明的技术方案是，将鸭疫里默氏菌血清1、2、4型分离株分别进行培养，灭活后加入吐温-80制成油乳剂的水相；利用马可52轻质石蜡油及司本-80、硬脂酸铝制成油相。将水相和油相等体积混合后乳化，从而得到鸭疫里默氏菌三价灭活疫苗。其具体制备方法如下：

1)细菌的培养：将鸭疫里默氏菌血清1型、2型和4型三株种子菌分别接种于TSA固体培养基，37℃恒温箱中培养，24h后挑取单个菌落，接入含小牛血清的LB液体培养基中，37℃、180r/min条件下振荡培养12-16h后再将此菌液按3％的比例加入新配制的LB液体培养基中进行大量增殖。37℃、180r/min振荡培养24h后，收集菌液，用分光光度计测定细菌总菌含量。

2)细菌的灭活：按TSB液体培养基总体积加入0.3％甲醛灭活，于37℃振荡灭活11-13h。

3)油乳剂水相的制备：三个血清型的菌种灭活后，将各个血清型的菌液浓度均调至1×10¹⁰CFU/ml，按1∶1∶1的体积比混合，按总体积4％加入灭菌吐温-80，边加边搅拌。4)油相制备：取马可52轻质石蜡油93份，加入硬脂酸铝1份并搅拌直到透明为止，随后加入6份司本-80，充分混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温备用。

5)油乳剂灭活苗的制备：将制备好的油相和水相等体积混合，边加边搅拌，至完全溶解，并于均质机中进行乳化。

本三价油乳剂灭活苗的保存条件为：2～8℃。

本发明的优点是可以预防由鸭疫里默氏菌血清1、2、4型菌株引起的疾病，对于同血清型菌株的免疫保护达到83％。相对于目前的商品疫苗来讲，可以单针免疫较多的血清型，使用方便，并提高了对其他血清型交叉保护的可能性。

具体实施方式

结合实施对本发明做进一步描述和论证。

实施例1

已制备好的鸭疫里默氏菌血清1型、2型、4型三价油乳剂灭活疫苗，3日龄樱桃谷鸭70只，灭菌生理盐水，规格为1ml注射器，疫苗菌株。

实验步骤：

1、70只3日龄樱桃谷鸭分为注射疫苗组30只，攻毒组30只，空白对照组10只。

2、疫苗组雏鸭每只颈部皮下注射疫苗0.5ml，空白对照组注射等量灭菌生理盐水。

3、全部雏鸭均置于相同条件下饲养，14d后，进行攻毒保护试验。

4、先将每个疫苗菌株扩繁11-13h，然后将浓度均调至2×10⁹CFU/ml。做攻毒保护试验时，将注射疫苗组雏鸭分为3组，每组10只，分别颈部皮下注射SWS1、SWS2、SWS4菌株菌液，每只雏鸭注射菌液1ml。攻毒组也分为三组，每组10只，攻毒组的攻毒方式同疫苗注射组。攻毒后，注意观察雏鸭的临床症状，并记录死亡时间和死亡率。

实验结果：攻毒对照组在72h内，死亡率均在70％以上，而疫苗免疫组的攻毒保护率均在80％左右。

实施例2