[发明专利]一种污染物致DNA去甲基化能力定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种污染物致DNA去甲基化能力定量检测方法。

背景技术

有毒有害的污染物在人类生存环境中广泛存在。为了了解各种污染物的健康危害能力大小，为公众提供一个相对安全健康的生产生活环境，对食品、饮用水、空气中的污染物的健康损害能力进行检测已经成为食品安全、饮用水安全、环境保护、公共卫生等相关领域的重要内容。近年来研究发现污染物可以通过改变人体DNA的甲基化水平，进而影响关键基因表达并导致白血病等各种严重的健康损害。污染物去甲基化能力越强，其导致人体产生健康损害的风险就越大。对污染物的去甲基化能力进行定量检测已经成为多方关注的内容。由于缺乏相关理论技术支持，目前尚没有成熟的检测技术可以用于评价污染物致DNA去甲基化的能力强弱。

目前污染物的健康危害检测方法主要包括一般毒性试验和致突变、致癌、致畸等特殊毒性试验，其中基因突变等遗传学损伤能力评估是人们关注的重点。许多所谓“安全”的污染物其实并不安全，一些通过现有安全性评价检测的污染物，没有发现存在明显的基因突变、染色体畸变等损伤能力，却依然可以通过致人体DNA去甲基化的途径导致癌症等健康危害。污染物的致DNA去甲基化的能力目前尚没有方法进行定量评价。

国外有学者曾尝试利用分子重组技术来检测去甲基化污染物。但是无法对污染物的去甲基化能力进行定量，也没有实际应用的报道(Okochi-Takada E，Ichimura S，Kaneda A，et al.Establishment of a detection system fordemethylating agents using an endogenous promoter CpG island.Mutat Res，2004；568(2)：187-94.)。我国有学者提出可以在常规的动物实验中，进一步分析DNA的甲基化水平；但由于难以操作，截至目前仍没有比较成熟的检测技术出现(杨建平，朱志良，袁建辉，等.DNA甲基化在毒理学中的应用前景.环境与职业医学，2007；24(5)：546-9.)。

总体来说，目前的检测方法只关注了污染物导致人体健康损害能力的一个方面；而对于污染物致人体DNA去甲基化的能力，目前由于缺乏相应的检测方法不能进行定量检测。

发明内容

为了检测污染物致人体DNA去甲基化的能力，评估其进入人体后的健康损害风险，本发明的目的在于创立一种快速、简易、可定量的污染物致人DNA去甲基化能力检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括：荧光质粒的人工甲基化处理方法；高甲基化荧光质粒转染Hela细胞制备重组细胞株；污染物样品前处理；5-AZA标准系列与重组细胞株的同步共培养；受试样品与重组细胞株的同步共培养；重组细胞株的荧光摄片与荧光强度处理；污染物去甲基化能力检测标准曲线的绘制；受试样品污染物去甲基化能力的定量检测。具体步骤为：

1、荧光质粒的甲基化处理：购买绿色荧光质粒EGFP-C3，以下简称C3质粒，采用DNA甲基化酶Msss.I，对C3质粒进行人工甲基化处理，使C3质粒中的EGFP基因CMV启动子区处于70～95％的高甲基化状态；

2、高甲基化荧光质粒转染Hela重组细胞株：将制备获得的高甲基化的C3质粒转染进入Hela细胞，制备Hela重组细胞株，然后将Hela重组细胞株传代于24孔板中；

3、污染物样品前处理：在各种污染物样品中加入硝酸，普通电热板上400℃消化1小时，待液体变澄清后烘干得到结晶，加入水将烧杯中结晶溶解备用；

4、5-甲基胞嘧啶与重组细胞株的同步共培养：以5-甲基胞嘧啶，以下简称5-AZA，配置标准系列，取10μl的5-AZA标准系列溶液分别加入到500μl的细胞培养液中，与Hela重组细胞株进行共培养18～36小时，使培养终浓度分别为0.0016μM，0.008μM，0.04μM，0.2μM；

污染物样品与重组细胞株的同步共培养：取步骤3中10μl的上述污染物结晶溶解液，加入到Hela重组细胞株培养液中，与5-AZA标准系列进行同步共培养18～36小时；

5、重组细胞株的荧光摄片与处理：对24孔板中的受试细胞株进行荧光摄片，每个细胞孔随机选取6-10个视野，每个视野摄片1次；对每个照片的荧光强度进行定量，获取每个受试细胞孔的荧光强度；

6、标准曲线的制备：将标准系列细胞孔的5-AZA浓度与其荧光强度进行回归拟合，制备标准曲线；横坐标为5-AZA的浓度，纵坐标为相应的荧光强度；