[发明专利]金磁微粒标记免疫层析快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫层析分析法，具体涉及采用金磁微粒标记免疫层析的快速检测方法，主要应用于激素、蛋白质、病毒、毒品、细菌、药物分子、毒素、重金属等检测领域。

背景技术

现有的胶体金和乳胶颗粒标记的免疫层析分析法已经在临床医学检验中得到了广泛的应用，其基本原理是以微孔膜为固相载体，包被目标物(即被测物)的抗原或抗体，加入待检样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细作用是标本中的目标物语膜上的包被的抗原或抗体结合，通过胶体金与之反应形成胶体金本身的颜色(红色)或者乳胶颗粒的(蓝色)，可通过肉眼观察检测结果。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，标记物的颜色很淡几乎用肉眼难以判断结果，同时由于每个检测人视觉上的差异，也很难得到统一的判断效果，同时对一些待检测样本的定量检测也有很大困难，虽然目前市场上有针对胶体金等标记的免疫层析试纸条判读的仪器来减少人为原因的差异，但是这种仪器仅能对在固相载体表面的标记物颜色检测，而对固相载体内部的标记物很难检测到，因此检测的灵敏度受到很大限制。同时检测的生物样本中可能含有颜色物质会严重影响检测的结果和灵敏度。

发明内容

本发明提出应用金磁微粒标记免疫层析检测条的快速检测方法，旨在解决传统免疫层析分析法的检测方法在临床实践中易造成主观差异化、检测精度和灵敏度低、操作繁复、适用领域窄的问题。

本发明的基本指导思想是：金磁微粒偶联抗体或配体或抗原以后在与之匹配的工作液和免疫层析装置中能够快速，定量的高灵敏度地检测被分析物。

本发明提出的金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，包括以下步骤：

1)金磁微粒标记待检目标物的抗体或者配体或者抗原，并溶解在层析工作液中；

1.1)取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，然后将待检目标物的抗体或配体或抗原按照与金磁微粒质量比10～500μg∶1mg加入经平衡处理后的金磁微粒中，置于0～50℃、50～220rpm的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；

所述偶联缓冲液为pH＝4-9，0.005-0.5M的磷酸盐缓冲液、pH＝3-6，0.1-3M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液或pH＝6-9，0.01-3M的醋酸盐缓冲液中的一种，所述金磁微粒为核壳结构、组装结构、磁性氧化铁组装在核壳结构外层的金磁微粒或者基于以上三种结构进行表面功能化修饰的金磁微粒；

1.2)于空气恒温振荡器中反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，得到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微粒；

所述清洗缓冲液为下列任一溶液：pH＝4-9，0.005-0.5M，且含有0.5-5％Tween20或者0.5-5％Triton X-100的磷酸盐缓冲液；pH＝6-9，0.1-3M且含有0.5-5％Tween20或者0.5-5％Triton X-100的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；pH＝3-6，0.01-3M且含有0.5-5％Tween20或者0.5-5％Triton X-100的醋酸盐缓冲液；pH＝6-9，0.1-10M且含有0.5-5％Tween20或者0.05-2％Triton X-100的硼酸盐缓冲液；pH＝2-5，0.01-1M且含有0.5-5％Tween20或者0.5-5％TritonX-100的甘氨酸-盐酸缓冲液；

1.3)封闭：加入500ul～2ml的封闭剂到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微粒中，置于20～80℃、50～220rpm的恒温振荡器中充分混匀5min～12h进行封闭；

所述封闭剂是采用上述偶联缓冲液溶解了以下物质的一种或多种：牛血清白蛋白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清、山羊血清；上述组分的终浓度均为0.05％-10％；

1.4)将偶联抗体且封闭完毕的金磁微粒在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除未结合的生物分子，最后将此偶联有抗体且封闭完成的金磁微粒溶解在层析工作液中；