[发明专利]一种重复使用的质粒提取试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸提取分离技术中使用的质粒提取试剂盒，特别涉及一种重复使用的可以从裂解液中提取分离质粒的试剂盒及其应用，属于分子生物学和药用质粒提取技术领域。

背景技术

质粒提取是分子生物学和药用质粒研究领域中常见的操作。近年来，基因治疗和DNA疫苗在癌症、单基因遗传病、艾滋病、心血管疾病、关节炎等重大疾病的诊断和治疗方面显示了突出的优势，其应用研究正日益发展。目前质粒逐渐成为基因治疗的最重要的基因传递系统，应用于基因治疗的药用质粒的提取技术的发展目前已成为该领域研究的重点之一。这进一步促进了高纯度质粒提取技术的发展。

质粒提取试剂盒因操作方便、提取效率较高成为质粒提取的主要方法。20世纪90年代以来，商品化的试剂盒提取质粒已非常普遍。试剂盒通常采用碱裂解结合质粒纯化柱分离纯化的方法提取质粒。试剂盒的主要生产厂家有Qiagen、Promega、Life Technologies、Stratagene和Nest Group，Inc.等国外公司，以及Tiangen和博大等国内公司。目前试剂盒中选用的质粒纯化柱材料通常为硅胶，其分离原理是利用质粒与硅胶的吸附作用纯化质粒，相互作用依赖于DNA的碱基组成和拓扑学结构，但该材料的吸附性能会受到片断长度的影响。一般硅胶材料会制成球形，制备过程中除了包括球形粒子制备步骤外，还需要筛分粒径适宜的粒子，同时还会受到柱装填技术的影响。而质粒吸附材料一般采用碱再生，而常用的硅胶型吸附材料由于在碱性环境下会溶解，而难以重复使用。而且，目前使用的高纯度质粒纯化柱主要是国外公司出产的Qiagen等进口试剂盒。因此质粒提取成本非常高。

发明内容

针对目前质粒提取试剂盒成本高、质粒提取纯化柱制备复杂、材料传质性能差、利用率有限、容量低、通常采用的硅胶材料无法重复使用，而且该产品主要依靠进口，价格昂贵，本发明的目的是提供一种提取质粒纯度高、可重复使用的大幅度降低质粒纯化操作成本的试剂盒。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种重复使用的质粒提取试剂盒，包括质粒纯化柱、质粒纯化柱配有的系列溶液和菌体裂解液，其特征在于：所述的质粒纯化柱采用整体床型质粒纯化柱，该整体床型质粒纯化柱采用以下方法合成：

1)将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类单体或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合，得到反应混合物，其中：

a.所述交联剂与单体的物质的量的比值为0.25～0.35；

b.所述引发剂与单体的物质的量的比值为0.005～0.03；

c.所述致孔剂用量占反应混合物体积百分含量的40～80％；

2)将上述反应混合物超声混和均匀，加入到塑料纯化柱管中，原位聚合形成整体床，聚合温度控制在50～70℃之间，反应时间为12～24小时；

3)聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；

4)将胺类修饰剂溶于有机溶剂，形成修饰液，利用修饰液对整体床进行改性，其中胺类修饰剂占修饰液的体积百分含量为25～75％，修饰温度控制在50～70℃之间，反应时间为12～24小时；

5)修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床，得到整体床型质粒纯化柱；

所述整体床型质粒纯化柱配有的系列溶液包括平衡液、清洗液、洗脱液、再生液和储存液，其中：

所述的平衡液pH 7.0～8.0，平衡液的组分和含量分别为：

Tris    10～50mM

EDTA    15～20mM

NaCl    0.1～0.3M

所述清洗液pH 7.0～8.0，清洗液的组分和含量分别为：

Tris    10～50mM

EDTA    15～20mM

NaCl    0.4～0.7M

所述洗脱液pH 7.0～8.0，洗脱液的组分和含量分别为：

Tris    10～50mM

EDTA    15～20mM

NaCl    0.9～1.5M

所述再生液的组分和含量分别为：

NaOH    0.5～1.5M

所述储存液的组分和体积百分含量分别为：

乙醇溶液  20～50％。

上述技术方案中，所述交联剂采用含有三个双键的化合物，优选采用三聚异腈尿酸三烯丙酯和三甲基丙烯酸丙三醇酯中的任一种。

所述的致孔剂采用饱和烷烃和芳烃中的至少一种；其中饱和烷烃优选采用正庚烷、正辛烷和正壬烷中的任一种；所述芳烃优选采用甲苯、乙苯和二甲苯中的任一种。