[发明专利]一种基于Tgf2转座子的鱼类基因转移载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及构建一种基于鱼类Tgf2转座子的基因转移载体，同时还公开了该载体涉及的转基因供体质粒和转座酶辅助质粒载体的构建方法，及其在斑马鱼和养殖鱼类中的应用。属于鱼类基因工程领域。

背景技术

随着人民生活水平的提高，人们对包括鱼、虾、贝、藻在内的优质水产品有较大需求。通过转基因来改良水产养殖对象的生长、抗逆和肉质等方面的种质是一种极其有效的途径。早在1984年我国朱作言等即研制出世界上第一批转基因鱼，建立了转基因鱼理论模型。水产转基因研究尽管成就斐然，但是，仍然存在许多不足之处，例如，鱼类早期的转基因表达载体仅是带有目标基因的质粒，该技术不仅难以做到定点整合，而且整合效率很低，在后代的遗传率通常低于5％，可供转移的有效启动子、功能基因和通用载体缺乏，很难应用于不同繁殖类型的水产养殖动物，如不能在浮性卵、黏性卵鱼类、排卵量较少的鱼类和卵子较小的虾类中进行有效转基因育种。另外，与目标性状相关的功能基因缺乏，所转的功能基因或基因组合不能确实完成抗逆、肉质改良和促生长目标。因此，现阶段仍需进一步建立简便、安全、高效和通用的转基因和基因捕获方法。

转座子主要分为两类：一类是具有类似反转录病毒结构的Ⅰ型转座子，即逆转录转座子，采用“复制粘贴”机制，首先将DNA转录为RNA，在反转录酶的作用下合成DNA，反转录的DNA插人染色体的其他部位，结果在染色体上的位置发生了移动。另一类是Ⅱ型转座子，即DNA转座子，主要采用“剪切-粘贴”的转座机制，将DNA从染色体上切下来后直接插入到别的部位，由两端较短的反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)和编码转座酶的基因组成。作为基因转移和表达系统的DNA转座子在细菌、真菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物中已有较多应用。随着McClintock于1951年在玉米中首次发现了AC转座子后，利用转座子在受体基因组的可整合性，构建了果蝇P因子、hobo因子、piggyBac转座子和mariner因子，并已成功地转化了多种外源基因。脊椎动物中也存在很多转座子，但是此类转座子的转座酶大多在漫长的进化中失活。直到1996年，日本学者Inagaki H和Koga A等对青鳉的白化变种进行连锁分析的时候发现了在白化变种的青鳉的酪氨酸酶基因插入了一个4.7kb左右的片段，他们经过克隆和分析最终把其命名为Tol2，不久之后发现了Tol2具有天然活性。这是在脊椎动物中第一个发现的天然有活性的转座子。

2008年，发明人发现一个新的具有天然活性的hAT转座子，该转座子在我国一些金鱼品种中广泛存在，命名为金鱼Tgf2转座子。金鱼Tgf2转座子是迄今发现的第二例脊椎动物转座子。与青鳉Tol2转座子元件相同，金鱼Tgf2转座子含有末段倒位重复、亚末端重复、中间倒位重复和活性转座酶基因，金鱼Tgf2与青鳉Tol2转座子在末段倒位重复和转座酶基因编码上存在一定差异，这些差异为开发新的高效鱼类Tgf2转座子提供了可能。本发明所涉及的一种源于鱼类Tgf2转座子的简便、高效转基因元件的构建就是建立在金鱼Tgf2转座子发现的基础上。

发明内容

本发明就是为了解决上述问题，克服金鱼Tgf2与青鳉Tol2转座子在末段倒位重复和转座酶基因编码上存在一定差异的问题，本发明的目的是提供一种基于Tgf2转座子的鱼类基因转移载体，本发明还公开了所述载体的制备方法，具有操作简单、转化效率高和低成本的特点。该发明适用于鱼类基因功能研究和转基因育种的研究。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

作为本发明的一方面，一种基于Tgf2转座子的鱼类基因转移载体，其特征在于，包括Tgf2转座子转基因供体质粒和表达Tgf2转座酶的辅助质粒。

其中，所述Tgf2转座子转基因供体质粒包括：Tgf2转座子包含反向重复序列的左右臂序列和鱼类特异性表达蛋白的调控元件。

其中，所述辅助质粒在鱼类特异性表达蛋白的调控元件指导下表达Tgf2转座酶。

其中，所述Tgf2转座子的左右臂序列及转座酶选自金鱼。

进一步，所述供体质粒的鱼类特异性表达蛋白的调控元件为斑马鱼krt8启动子序列。

进一步，所述辅助质粒的鱼类特异性表达蛋白的调控元件为斑马鱼β-actin启动子序列。

作为本发明的另一方面，一种基于Tgf2转座子的鱼类基因转移载体的制备方法，包括以下步骤：