[发明专利]用于胚胎体外生产的培养液以及牛胚胎体外生产的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于胚胎体外生产的培养液以及牛早期胚胎体外生产的方法。

背景技术

动物胚胎移植是指将从一头受孕母畜(供体)的生殖管道中取出的受精卵或发育到一定时期的早期胚胎，移植到与供体母畜同步发情的母畜(受体)生殖管道的一定部位，使其继续生长、发育，长成子畜的技术。利用胚胎移植可以缩短动物繁殖周期，进一步挖掘动物的繁殖潜力，为优良牲畜的大量繁殖，稀有动物的种族延续提供有效的解决办法，在畜牧业和制药业等领域发挥重要的作用。

由于从供体母畜收集受精卵易受动物生殖周期的影响，现在胚胎移植大都采用动物早期胚胎进行移植，这就使动物早期胚胎的体外培养在胚胎移植中占有重要地位。动物早期胚胎体外培养是指将采集到的卵母细胞在体外经人工培养成熟后，通过体外受精、核移植和孤雌激活等技术使卵母细胞受精或被激活，然后移至体外培养基中使其生长发育至囊胚期的胚胎工程技术，该技术可以不受动物生殖周期的影响，大规模地进行动物早期胚胎的体外生产。

胚胎的体外培养已有40多年的发展历史。目前，胚胎在体外培养条件下能够存活并发育，移植后能够妊娠产仔，在胚胎工程和生产实践中有了广泛的应用。目前体外胚胎的生产效率仍然很低，胚胎的质量与体内胚胎相比还存在很大的差距。牛胚胎体外主要存在的问题为：受胎率偏低、妊娠期延长、流产率增加、牛犊的生命力强弱不一、性比例偏斜、围产期和新生期犊牛的死亡率和畸形率增加等。其主要原因是体外培养体系还不能完全模拟母畜体内环境，还不够稳定。在体内，胚胎通过输卵管迁移至子宫，胚胎暴露于动态环境。而已经发展起来的绝大多数胚胎培养系统都是在一段时间相对平衡稳定的环境，胚胎仍然处于一个相对静止的环境，还无法完全模拟出与雌性生殖道相同的物理或环境条件，无法适应早期胚胎分化发育的需求。因此，胚胎的体外培养体系还有待于进一步的优化、改进。

目前常用的培养方法是体细胞共培养和序贯培养两种。共培养是辅助细胞或体细胞与胚胎在体外一起培养，更佳地模拟了胚胎在体内的发育环境，各种体细胞的混合培养以及一些生长因子的添加都极大地推动了体外受精技术的进一步完善。该培养系统可以促进胚胎的发育，高胚胎质量，使囊胚的形成率得到提高。然而共培养系统中有很多不确定因子，并且体细胞可能充当病原的传播载体，产生对胚胎的污染。

序贯培养是根据体外培养的胚胎在不同生长时间里对不同物质需求和代谢的不同，配制一系列不同成分的培养液，进行序列更换，从而延长胚胎在体外的培养时间，增加体外筛选机会的方法，但该方法需要更换多种培养基，所用培养基需要筛选，操作麻烦，而且容易污染。

各培养系统的培养液成分是整个培养过程中最为关键的部分，它决定了动物早期胚胎生长发育率。目前TCM-199、CZB、KSOM等单纯的基础培养液不能完全模拟胚胎体内发育的环境，并且不能完全提供早期胚胎发育所必须的营养和非营养物质，由此极大降低了胚胎发育成囊胚的效率。就牛早期胚胎体外生产而言，这些问题尤为突出，极大地制约着畜牧业的发展。

发明内容

有鉴于此，本发明的一个目的是提供一种用于胚胎体外生产的培养液，所述培养液可显著促进体外胚胎向囊胚的发育，提高囊胚发育率从而进一步提高牛体外胚胎生产效率。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述用于胚胎体外生产的培养液为包含5-10mmol/L Hepes、15-26.2mmol/L NaHCO₃、30～50μg/L的BDNF以及3-5％OCS的TCM-199基础培养液。

BDNF，脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor)，主要存在于大脑和外周组织，对神经细胞的分化和神经元存活具有重要作用。最近研究表明，这些因子也表达在一些非神经系统中，如心血管、免疫、内分泌、生殖系统，并且参与调节这些系统的功能。

在本发明的具体实施方式中，发现BDNF在不同发育阶段的卵母细胞和胚胎以及不同方法生产的早期胚胎中均有表达，BDNF对早期胚胎发育有促进作用。用含BDNF的培养液培养早期胚胎，当BDNF浓度介于30～50μg/L时，显著提高牛体外胚胎向囊胚的发育。本领域技术人员可根据常识将其应用于其它哺乳动物如马、羊等的胚胎体外生产。同样的，所述培养液也可以提高显著促进发育，提高早期胚胎的囊胚发育率。

作为优选，所述用于胚胎体外生产的培养液中BDNF浓度为40μg/L。