[发明专利]一种植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法有效
申请号: | 201010224740.5 | 申请日: | 2010-07-13 |
公开(公告)号: | CN101870998A | 公开(公告)日: | 2010-10-27 |
发明(设计)人: | 吴卫;徐应文;刘正琼;邵金凤;赵丹;杨文婷 | 申请(专利权)人: | 四川农业大学 |
主分类号: | C12Q1/30 | 分类号: | C12Q1/30;C12Q1/28 |
代理公司: | 成都九鼎天元知识产权代理有限公司 51214 | 代理人: | 刘明芳;吴彦峰 |
地址: | 611130 四*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 植物 超氧化物歧化酶 过氧化氢酶 过氧化物 活力 检测 方法 | ||
技术领域
本发明属于植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法技术领域,特别涉及一种植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法。
背景技术
植物在生理代谢过程中伴随着部分电子逃逸,产生具有毒害作用的高能量活性氧,其中包括O2-、H2O2、单线态氧、羟自由基等。植物细胞的叶绿体、线粒体和质膜等是活性氧产生的主要场所。这些活性氧的积累会使植物细胞受到氧胁迫。为了减轻活性氧对细胞的破坏,维持体内活性氧的动态平衡,植物在进化过程中逐渐形成一套抗氧化酶促系统,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)。这三种酶的作用分别是SOD催化O2-歧化反应生成H2O2,CAT分解H2O2,POD清除O2-、H2O2和其他过氧化物,与植物的生理代谢和抗逆性有密切关系。植物在生长发育过程中会受到各种不良环境的影响,包括生物胁迫和非生物胁迫。处于逆境下的植物往往会产生大量活性氧,从而也引起抗氧化酶促系统中的酶产生量发生变化以清除过多的活性氧、减少植物受到的氧胁迫。SOD、CAT和POD酶活力的变化能反映出植物所受到的胁迫状况及植物抗逆能力的强弱。因此,上述三种酶是植物生理研究中的重要研究对象,其酶活力的检测是其重要环节。
酶活力(enzymeactivity)也称为酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下,酶催化某一化学反应的速度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
上述三种酶活力的传统检测方法分别是:
1)SOD酶活力的检测方法:
先用冰浴研磨法和0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液制备粗酶液,然后用硝基四唑淡蓝法测其酶活力;
取1g植物叶片等组织于预冷的研钵中,加入预冷的0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液,研磨成浆,定容后低温离心,上清液为SOD粗酶液;
硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力:酶促反应体系包含0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液、0.013mol/L甲硫氨基酸溶液、75μmol/L硝基四唑淡蓝溶液、10μmol/LEDTA-Na2、2μmol/L核黄素和0.01-1mL酶液;以不加酶液的反应体系为对照反应体系;将上述加酶液的反应体系装于指形管(或其它透光性好的容器)中并混合均匀,然后置于4000Lx日光灯下反应20min;将上述不加酶液的对照反应体系装于另一指形管中作为对照管,混合均匀后置于暗处放置相同时间。反应结束后以不照光的对照管作为空白,在波长560nm下分别测定各管的吸光度。以抑制硝基四唑淡蓝光化反原为蓝色的甲腙的50%为一个酶活单位计算SOD活性。
2)CAT酶活力的检测方法:
先用冰浴研磨法和0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液制备粗酶液,然后用紫外吸收法测其酶活力;
取1g植物叶片等组织于预冷的研钵中,加入预冷的0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液,研磨成浆,定容后低温离心,上清液为CAT粗酶液;
紫外吸收法测定CAT酶活力:酶促反应体系包含0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液、0.01mol/LH2O2和0.01-1mL酶液;将上述反应体系于波长240nm下测定吸光度的变化量,以每分钟内吸光度减少0.01为一个酶活单位计算CAT酶活性。
3)POD酶活力的检测方法:
先用冰浴研磨法和0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液制备粗酶液,然后用愈创木酚法测POD酶活力;
取1g植物叶片等组织于预冷的研钵中,加入预冷的0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液,研磨成浆,定容后低温离心,上清液为POD粗酶液;
愈创木酚法测定POD酶活力:酶促反应体系包含0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液、0.01mol/LH2O2、0.005mol/L愈创木酚溶液和0.01-1mL酶液;将上述反应体系于波长470nm下测定吸光度的变化量,以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活单位计算POD酶活性。
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