[发明专利]红豆杉细胞培养物及其大规模继代培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及药用植物的细胞培养物及其培养方法，特别是涉及一种红豆杉细

胞培养物及其培养的方法，属植物生物技术工程领域。

背景技术

红豆杉系红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)的一类乔木和灌木，全世界共11种，从欧亚大陆和北美的亚北极区到中美和东南亚的亚热带甚至热带地区均有分布。紫杉醇是一种二萜类生物碱，经临床证明对治疗卵巢癌、肺癌、结肠癌、转移性乳腺癌、黑色素瘤、白血病等多种癌症有特效，致使紫杉醇成为当前最热门的抗癌药物之一。

目前紫杉醇主要从树皮中获取，来源极其有限，这不仅破坏了红豆杉资源和生态平衡，也根本无法满足人们对紫杉醇日益增长的需求。因此应用细胞培养的方法进行红豆杉的开发即可以满足临床对红豆杉药物的需求，也可以保护自然资源，维护生态环境。但在有关红豆杉组织培养的研究报道中，因存在许多问题极大地限制了其在实际生产中的应用，存在的问题有：在放大过程中不稳定，当放大培养到一定规模后有效成分的含量会降低；没有找到有效的筛选高产细胞系的手段等。

发明内容

本发明目的是提供一种红豆杉细胞培养物及其大规模继代培养的方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的。

本发明红豆杉细胞大规模继代培养的方法包括以下步骤：

I、植株诱导：

将保藏的红豆杉用70～75％酒精浸泡25～30秒钟，再用0.1～0.15％的升汞摇晃灭菌10分种，最后用无菌水洗4～6次；将灭菌彻底的种子于无菌条件下，去种皮，接种在配好的植株诱导B5培养基上，每25ml培养基中接种4粒种子；在25℃，暗培养，10-15天，出芽后，培养成红豆杉植株；

II、诱导愈伤组织：

红豆杉植株继续培养至5～8cm，选取生长良好的红豆杉植株作为外植体；将外植体接种于诱导愈伤组织B5培养基上，每25ml培养基中接种6～10块直径为0.5cm的外植体，暗培养35～40天，温度为22℃～28℃；诱导出红豆杉愈伤组织。

III、培养物继代培养：

筛选高产细胞系，选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织进行周期性的继代培养，培养周期为35～40天，培养温度为20～30℃；至培养期，选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织作为种子，种子量为生产量的15％。剩余75％生产量的培养物继代到B5培养基中，每25ml培养基中接种8块直径为0.8-1.0cm的细胞培养物，光培养，光照条件为3-6小时/天，白光，温度为22℃～28℃。培养30-35天后收集，低温真空干燥即为红豆杉细胞培养物。

上述III步骤中低温真空干燥条件为真空回旋干燥，干燥温度为40℃。

本发明红豆杉细胞组织的培养方法具有以下的优点：

1、由于采用合理的筛选方法使红豆杉细胞培养物的有效成分含量比野生红豆杉5～8倍。

2、采用此方法培养红豆杉细胞组织生长周期短，生长周期为30-35天，野生红豆杉的生长周期为8～10年。

3、采用此方法不需占用耕地；

4、采用此方法不需采伐野生红豆杉，保护了生态环境；

5、本发明在实际生产中具有较强的可行性，对于解决红豆杉资源短缺的现状具有重要的实际意义。

本发明与采用生物反应器大规模培养红豆杉比较，优点在于：设备简单，投入成本低，易于实现产业化；采用固体培养基，培养产物易于干燥，降低了后处理的难度；缩短了工艺流程，染菌机率降低，提高产成品率；采用气升式生物反应器在放大过程中紫杉醇含量明显下降，继代培养的方法紫杉醇含量稳定，产品质量易于控制。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1红豆杉高产优质细胞系的获得

取天然红豆杉的种子，用75％的酒精溶液浸泡30秒，用0.1％升汞溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4-5次；用含有赤霉素1.0mg/L-0.2mg/L的溶液中浸泡24小时；浸泡24小时后，将种子再次使用0.1％升汞溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4-5次；在无菌条件下剥去种子外壳，撕去种子内膜，将去皮种子接种在配好的植株诱导B5培养基(赤霉素1.0mg/L-0.2mg/L)上，每40毫升培养基播种4粒种子；在25℃下，避光培养4-6天，待种子发芽后，培养成红豆杉植株。