[发明专利]两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物及其表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋生物的基因工程技术，尤其是涉及一种对具有抗菌活性的大黄鱼抗菌肽hepcidin(简写为PC-hepc)和黑鲷抗菌肽hepcidin(简写为AS-hepc2)基因进行串联表达，并进行体外表达产物的活性鉴定。

背景技术

抗菌肽是由动植物细胞产生的一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽，其生成和释放是机体炎症反应的组成部分，是宿主防御细菌、真菌等病原微生物入侵的重要屏障。Hepcidin(肝杀菌肽)是一个具β片层结构的在C端保守位点上富含半胱氨酸残基的抗菌肽家族，参与宿主非特异性免疫。2000年，Krause等从人血浆中首先发现了LEAP-1(肝脏表达的抗菌肽，后称为hepcidin)，并用化学合成该多肽检测了hepcidin的抗菌活性，结果发现，hepcidin能够剂量依赖性地抑制革兰氏阳性菌藤黄微球菌、肉葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌灰色奈瑟球菌的生长，但是对大肠杆菌和萤光假单胞菌没有活性。Park等从人尿液中分离的Hep20和Hepc25天然产物，体外抗菌试验中在30μM浓度下对大肠杆菌(E.coliML35P G-)具较强的抑制作用，对金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌的生长抑制作用较弱。相关报道表明，人hepcidin是一种具有广谱杀菌抑菌作用的抗菌肽，与机体内其他富含半胱氨酸的抗菌肽一样参与宿主的天然防御。

本申请人通过化学合成大黄鱼hepcidin成熟肽和原核表达AS-hepc2后进行体外实验也证实了鱼类hepcidin有抑菌和杀菌特性。有报道Hepcidin变体的氨基酸序列在种间高度相似，而与陆生哺乳动物具有的进化后高级适应性免疫系统相比，由于水生环境的复杂性和直接接触性，鱼类可能需要多种不同组抗菌肽存在，并且在先天性免疫系统中作为主要成分。对Hepcidin抗菌肽的研究必然加深人们对低等脊椎动物免疫防御机制的认识，同时hepcidin抗菌肽作为潜在的海水水产养殖抗菌和治疗药物，具有很好的推广应用前景。但直接从鱼类组织或分泌物中生物化学提取或利用化学方法人工合成天然的hepcidin抗菌肽，很难获得大量的抗菌肽，且费时费钱。利用分子生物学技术可以克隆获得海水养殖鱼类的抗菌肽基因，通过建立海水养殖鱼类hepcidin抗菌肽基因表达工程菌，可以在体外大量生产抗菌肽，进行抗菌活性检测和替代抗生素添加到饲料中，用于预防和治疗水产动物疾病。