[发明专利]乙脑病毒的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒

权利要求书

1.用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，是根据乙脑病毒E基因保守区域的保守区域设计的，用以定量检测样本中乙脑病毒的核酸拷贝数。

2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。

4.根据权利要求3所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为NFQ。

5.一种乙脑病毒的实时荧光定量PCR检测方法，是以权利要求1-4任一项所述的引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测方法。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：检测中，20μL实时荧光定量PCR反应体系包括：TaqMan探针+引物1μL(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)，样品cDNA 1μL(1μg/mL)，无RNA酶水8μL，TaqmanMix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10μL。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测的反应条件为：先50℃2min；然后95℃10min；最后95℃15sec，60℃1min，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

8.根据权利要求5或6或7所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括标准曲线的建立，方法为：用含乙脑病毒E基因的重组质粒pMD-JEV-E的DNA作为标准品，将其10倍系列稀释成8.86×10⁹拷贝/μL、8.86×10⁸拷贝/μL、8.86×10⁷拷贝/μL、8.86×10⁶拷贝/μL、8.86×10⁵拷贝/μL、8.86×10⁴拷贝/μL、8.86×10³拷贝/μL、8.86×10²拷贝/μL、8.86×10¹拷贝/μL。各取1μL质粒DNA作为模板DNA，进行实时荧光定量PCR检测，每份样本重复平行试验3次，得到用于乙脑病毒检测的标准曲线。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述建立标准曲线的20μL实时荧光定量PCR反应体系包括：TaqMan探针+引物1μL(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)，质粒DNA 1μL(0.0003219mg/mL)，无RNA酶水8μL，Taqman Mix 10μL；实时荧光定量PCR反应条件与权利要求7相同。

10.一种用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求1-4任一项所述用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。