[发明专利]一种生产重组蛋白A的方法

权利要求书

1.一种生产重组蛋白A的方法，包括表达蛋白A基因工程菌的高密度发酵及重组蛋白A的分离纯化方法；其特征在于如下步骤：

第一步，基因工程菌的高密度发酵；

本发明中所使用的基因工程菌，是将蛋白A完整的IgG结合功能区基因连接入pET表达载体中，再将上述重组质粒转入感受态E.coli BL21(DE3)中；

采用补料分批发酵的培养方式，利用指数流加的补料方法实现表达重组蛋白A基因工程菌株的高密度发酵；发酵培养基中的碳源选用葡萄糖或甘油，诱导重组蛋白A表达的诱导剂选用IPTG或乳糖；

第二步，重组蛋白A的分离纯化；

利用以IgG的Fc片段为配基的亲和层析填料分离纯化重组蛋白A；

(1)IgG的Fc片段的获取：采用木瓜蛋白酶酶解IgG，使其分解为Fc片段和Fab片段，通过以重组蛋白A为配基的亲和层析柱分离纯化Fc片段；

(2)以IgG的Fc片段为配基的亲和层析填料的合成：采用高碘酸钠氧化Fc片段糖侧链，利用反应后得到的醛基实现Fc片段的定向固定化；采用琼脂糖凝胶为基质，以羰基二咪唑活化，通过双功能团间隔臂分子将氧化后的Fc片段固定，合成了特异性结合重组蛋白A的亲和层析填料；

(3)利用以上合成的亲和层析填料分离纯化重组蛋白A。

2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白A的生产方法，其特征还在于，所述的基因工程菌的高密度发酵条件如下：

基因工程菌株的高密度发酵的基本培养基组成为：10-20g/L蛋白胨，5-10g/L酵母提取物，20-50mM Na₂HPO₄，20-50mM KH₂PO₄，20-50mM NH₄Cl，2-5mM MgSO₄；微量元素成分如下：FeSO₄、MnCl₂、ZnSO₄、NiCl₂、CaCl₂，浓度均为1-10μM；发酵用消泡剂加入适量(约0.1mL/L)，碳源为葡萄糖或甘油，其浓度为10-20g/L；

补料培养基组成为：200-500g/L葡萄糖或甘油，50-100g/L酵母提取物；

采用补料分批发酵，在基本培养基的碳源消耗了95％以上时，采用指数流加的补料方式保证菌体的比生长速率维持在0.05-0.2/小时；

补料分批发酵的操作条件为：接种量为0.5-5％(v/v)，发酵过程中的pH采用氨水和浓盐酸自动补加的方式控制在7-7.5，发酵温度33-37℃，通过搅拌速率和通气量控制溶解氧＞20％；

重组蛋白A的诱导表达采用IPTG或乳糖为诱导剂，IPTG的加入方式为：当菌体OD_600nm达到50-70时一次性加入，终浓度为0.2-1mM；乳糖的加入方式为：当菌体OD_600nm达到40-60时开始流加，维持发酵液中乳糖浓度在0.2-1g/L。