[发明专利]一种重组人20kD生长激素表达载体的构建、表达、单克隆抗体的制备及其细胞株

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种表达载体，特别是一种含有人20kD生长激素基因的表达载体；本发明还涉及该表达载体的构建和表达；本发明还涉及一种人20kD生长激素单克隆抗体的制备及分泌该单克隆抗体的细胞株。

背景技术

人生长激素(human growth hormone，hGH)又名促生长素(Somatropin)，是腺垂体前部的嗜酸性细胞合成、分泌的肽链，在垂体中产生的hGH主要有两种形式：分子量为22kD和分子量为20kD。

22kD GH在人体内是含量最多的生长激素，它是一条单链非糖化的、由191个氨基酸组成的亲水性球蛋白，约占垂体hGH的70％～75％，占血液循环hGH的43％。

20kD hGH约占血液循环中hGH的5％-10％。它由176个氨基酸组成，较22kD GH少了N端第32-46位的15个氨基酸残基，但是它仍然保持了22kD原有的两对二硫键，这样使得20kD GH可以正常折叠并具有和22kD GH相似的分子结构以及功能，同时也为特异分型单抗的制备带来了困难。

由于人体代谢的复杂性和运动员服用兴奋剂水平的提高，部分重点兴奋剂，如hGH(重组22kD GH)等现在被过度滥用。hGH的代谢和脂解作用有很多潜在的有益效应，如运动时增加心输出量、出汗率和脂解作用，改善内环境的热稳定，提供能量加强耐力运动，并且可能增加韧带强度和创伤愈合率，这些特点使得很多运动员意图通过服用外源的hGH去提高成绩。国际奥委会和主要的运动团体也因此明文禁止运动员服用外源hGH。

抗20kD GH的特异性单抗的制备已成为成功检测运动员服用外源性hGH的研究热点，越来越受到国际研究同行的重视。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组质粒表达载体，该载体含有人20kD生长激素基因。

本发明的另一目的在于上述质粒表达的蛋白在制备抗人20kD生长激素单克隆抗体中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种单克隆抗体，该单克隆抗体能特异性识别并结合20kD GH。

本发明的另一目的在于上述特异性单克隆抗体在制备人血清或尿液中20kD GH浓度的检测剂中的应用。

本发明构建含人20kD生长激素基因的重组质粒表达载体，在大肠杆菌中表达C端携带组氨酸标签的生长激素融合蛋白，在此基础上制备抗20kDGH的特异性单克隆抗体，并筛选获得分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为定量检测人血清或尿液中20kD GH的浓度奠定了基础。

本发明以22kD生长激素基因为模板，采用重组PCR方法扩增出20kD基因片段。采用的表达载体pTIG-Trx是原核高效分泌表达质粒，含有强的IIp启动子，通过选择合适的多克隆酶切位点，将全长的20kD生长激素基因插入，并使其C端带有6个组氨酸的尾巴，重组质粒DNA测序结果证实含有20kD生长激素目的基因(基因序列见序列表中的序列1)。将含有pTIG-Trx/GH质粒载体的菌株放入含有氨苄青霉素的培养基中进行培养，诱导表达后，离心收集菌体并进行15％SDS-PAGE分析，结果在分子量为20kD处出现了预期的目的条带(蛋白氨基酸序列见序列表中的序列2)。

本发明采用上述方法制备的20kD GH重组蛋白作为抗原，免疫BALb/C小鼠，加佐剂进行基础免疫和加强免疫后，分别采用杂交瘤技术和免疫学方法融合、克隆化并筛选20kD GH的单克隆抗体。因此，该单克隆抗体可特异用于制备人血清或尿液中20kD GH浓度的定量检测试剂。

附图说明(见后)

图1为采用重叠延伸PCR方法扩增20kD GH基因产物的电泳结果；

图2为重组表达质粒pTIG-Trx-20GH的EcoR I和Xho I双酶切鉴定结果；

图3为重组表达质粒pTIG-Trx-20GH的DNA测序结果；

图4为重组表达质粒pTIG-Trx-20GH在大肠杆菌中诱导表达的结果；

图5为20kD GH重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析结果；

图6为抗20kD GH的单克隆抗体特异性SPR分析结果。包括(A)图和(B)图。

图1中PCR产物的电泳结果表明，所扩增的ac和bd片段大小与预期一致，分别是110bp和438bp；重叠延伸获得的片段大小与20kDGH基因片段预期一致，为548bp(含有酶切序列和保护碱基)。