[发明专利]一种检测贝肉中镉-金属硫蛋白的酶联免疫吸附测定方法

说明书

技术领域

本发明属于一种检测贝肉中金属硫蛋白的酶联免疫吸附测定方法。

背景技术

由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染。在工业“三废”污染中，尤其以重金属如镉，汞，铅等环境污染最为突出。水生生物对镉的富集能力极强，水中的镉通过食物链富集后可在其体内达到相当高的浓度，如鱼类可富集10³～10⁵倍，贝类富集10⁵～10⁶倍。镉被人体吸收后，在体内形成镉蛋白，选择性地蓄积于肾、肝，其中肾脏可吸收进入体内近1/3的镉，是镉中毒“靶器官”。镉损伤肾小管，患者出现糖尿、蛋白尿和氨基酸尿，特别是使骨骼的代谢受阻，造成骨质疏松、萎缩、变形等一系列症状。

目前贝类镉含量的测定方法主要有原子吸收法、比色法和原子荧光法，这些检测方法的共同特点是要使用大型仪器，要对样品进行消化，消化过程中要使用大量的硝酸、高氯酸等带来环境污染，耗时长。另外由于贝类样品中镉的测定基体干扰较严重，测定结果的准确度和精密度存在较大的不确定性。

金属硫蛋白是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸、可被重金属、激素及各种细胞因子诱导的金属结合蛋白，它的一个显著特点是分子中的大量巯基与金属离子尤其是重金属离子具有很强的结合力，且可在转录水平上被环境中的金属所诱导合成，这种诱导可以反映出环境受金属污染的水平，故金属硫蛋白可以作为重金属污染的生物标志物，其研究成为环境与生物医学领域研究的热点。

酶联免疫吸附测定法是把抗原抗体免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性有机地结合起来的一种检测技术。由于酶的催化效率很高，使测定方法具有高敏感度。故本发明通过建立酶联免疫吸附测定法检测贝肉中金属硫蛋白的含量从而间接得出贝肉中镉含量。郑军恒等(1999)从人胎肝中分离提纯了金属硫蛋白的两个亚型，并用亚型1为抗原免疫青紫兰兔制备了抗血清，以纯化的抗体建立了人金属硫蛋白的酶联免疫吸附检测方法。Margarita Apostolova等利用从小鼠肝脏中提取的镉-金属硫蛋白诱导新西兰兔合成镉-金属硫蛋白抗体，并用此抗体建立了一种灵敏的酶联免疫吸附法检测血清和组织中的金属硫蛋白。吴力专建立的竞争型酶联免疫吸附法灵敏度约为4.1ng/ml。

国内外对金属硫蛋白提取制备及酶联免疫吸附法都有研究，而诱导家兔合成镉-金属硫蛋白抗体，再提纯抗体建立酶联免疫吸附法检测贝肉中的镉金属硫蛋白，从而间接检测贝肉中镉含量的研究还处于空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测贝肉中镉-金属硫蛋白的技术，它能有效的反应贝肉中镉的污染情况，为贝肉中重金属镉的检测提供了一种有效手段。

本发明包括如下步骤：

1.镉金属硫蛋白的诱导

将100μl 0.2mg/L～0.6mg/L的氯化镉注射到0.5～2年的企鹅珍珠贝中，每天注射1次，共注射6～8次，诱导贝体内大量合成镉-金属硫蛋白；

2.镉-金属硫蛋白的分离提纯

取出贝肉全脏器，用超纯水清洗，冰上剪碎，称量，加入2倍体积预冷的pH8.60.01mol/L的Tris-HCl缓冲液匀浆，匀浆后加入一倍体积的V(0.01mol/lTris-HCl，pH8.6)∶V(CH₃CH₂OH)∶V(CH₃Cl)＝1∶1.05∶0.08混合液，混匀，4℃静置过夜。10000～12000r/min离心20～30min，上清液置80℃水浴加热3～5min，同上离心。上清中加入3倍体积-20℃预冷的无水乙醇，搅拌，-20℃放置过夜，4℃下，10000～12000r/min，离心20～30min，沉淀用Tris-HCl溶解，同上离心，上清即为镉-金属硫蛋白粗提液。粗提液先后经Sephadex G-50、DEAE-52柱层析后得到镉-金属硫蛋白亚型，再经Sephadex G-25脱盐，冷冻干燥；

3.镉-金属硫蛋白抗体的制备

将100～150mg金属硫蛋白、200～300mg牛血清蛋白溶解于20～30mlpH7.00.1mol/L的磷酸缓冲液中，振荡下滴加1％戊二醛10～15ml，25～30℃反应2～3h形成偶联物，4℃保存。把偶联物注射到家兔中诱导镉-金属硫蛋白抗体的合成，每隔7～10天加强免疫一次，约2～3次后试血。用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1∶16以上时通过心脏采血法采血；

4.镉-金属硫蛋白抗体的提纯