[发明专利]甘薯茎尖的包埋玻璃化超低温保存方法

权利要求书

1.一种甘薯茎尖包埋玻璃化超低温保存方法，步骤如下：

(1)从甘薯的试管苗上取1～1.5mm甘薯茎尖；将甘薯茎尖移入到浓度为3克/100ml的海藻酸钠和0.2M甘油的无钙离子的MS溶液中，室温浸泡5～20秒；

(2)将含有11.1g/l CaCl₂、2M甘油、0.2M蔗糖的MS溶液在冰块中预冷15～25分钟，将步骤1的甘薯茎尖连同浸泡溶液一起加入其中，形成直径为0.5-0.8cm甘薯茎尖小球；将甘薯茎尖小球依次移入以下预培养基中进行预培养：

将小球移入盛有50ml预培养基I溶液的三角瓶中，预培养基I溶液配方为：MS+30g/l蔗糖+1g/l酪蛋白氨基酸，摇床培养24小时，25～28℃，60～90rpm；

将小球移入盛有50ml预培养基II溶液的三角瓶中，预培养基II溶液配方为：MS+0.3M蔗糖，摇床培养16小时，25～28℃，60～90rpm；

将小球移入盛有50ml预培养基III溶液的三角瓶中，预培养基III溶液配方为：MS+1.6M蔗糖+2M甘油，摇床培养3小时，25～28℃，60-90rpm；

制得预培养好的甘薯茎尖小球；

(3)将上述预培养好的甘薯茎尖小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25℃培养90～120min；

(4)将步骤(3)处理过的甘薯茎尖小球移入2ml规格的超低温管中，每个管中装8-10个小球，置入液氮中冷冻保存。

2.如权利权利要求1所述的甘薯茎尖包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于步骤(3)中PVS玻璃化溶液组成为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4M蔗糖，pH 5.8；百分比是质量体积比，单位：克/ml。

3.如权利权利要求1所述的甘薯茎尖包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于将冷冻保存的甘薯茎尖恢复培养时，继续以下步骤：

(5)将步骤(4)得到的盛有小球的超低温管从液氮中取出，迅速移到38℃的水浴锅中，解冻2-4分钟，将小球放入卸载溶液中，室温，放置20-25min；

卸载溶液组成为：1.2M蔗糖+MS，pH5.8；

(6)将步骤(5)得到的小球移入盛有25ml成活培养基的培养皿中，成活培养基配方为：MS+0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤+1mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，pH5.8，25℃黑暗培养3天；然后在24-28℃培养7天，并保持每天16小时的3000lux光照培养和每天8小时的黑暗培养，得成活小球；

(7)将上述成活小球移入盛有25ml再生培养基的培养皿中，在24-28℃培养并保持每天16小时的3000lux光照，培养成苗，每隔三周，将成苗小球转移到盛有新配的再生培养基的培养皿中。所述再生培养基配方为：MS+2.5mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，pH 5.8。待成苗小球的苗长达0.4-0.6cm时，转入MS固体培养基中生根。

4.如权利权利要求1所述的甘薯茎尖包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于所述甘薯品种为济薯18或济徐23。