[发明专利]一种夹心式单面孵育方法及其免疫印迹方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，是蛋白检测方法和技术的运用，特别涉及免疫印迹中一种节约型、夹心式的单面孵育抗体或检测试剂的方法及应用该孵育方法的免疫印迹方法。

背景技术

免疫印迹法(Western blotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，该技术主要用于检测特定的组织或细胞提取物中特定蛋白。其基本原理为利用SDS-PAGE电泳分离蛋白质混合物，随后将凝胶上分散开的蛋白质转移到固相载体(如聚乙二烯二氟化物膜，又称PVDF膜；硝酸纤维素膜)上，非共价键形式吸附蛋白质的固相载体能够保持电泳分离的多肽类型和蛋白质的生物学活性不变。随后，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与特异性的初级抗体发生免疫反应，再与酶或同位素标记的次级抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性蛋白的表达。

运用此项技术，可以检测一种蛋白的大致的分子量和不同样本中某种蛋白的相对含量(Renart et al.，1979；Towbin et al.，1979)。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法；该方法被广泛应用于分子生物学，生物化学，免疫遗传学等生物学领域。在标准的免疫印迹实验中，抗体能够特异性地与成百上千种的蛋白混合物中的一种蛋白即靶蛋白结合达到特异识别抗原的目的。因此，抗体特异性的强弱和其质量的高低是免疫印迹实验成功与否的决定性因素。目前，很多的抗体已经商品化生产，易于获得；但是商品化的抗体价格相对昂贵，其购买费用不菲。基于此，任何节约抗体的使用但不影响免疫印迹的实验结果的方法对于解决抗体的费用问题都是非常有用的。

目前，已有研究者利用热密封袋或者密封的塑料袋，在袋子中将膜与抗体进行孵育，或者直接将抗体添加到转移有蛋白印迹的膜的那一侧等方法来降低免疫印迹实验中对抗体等试剂的消耗。然而，第一种节约试剂的方法需要特殊的密封袋，而且在放置膜的时候，需要格外小心以防止膜的折叠。而添加抗体至膜的一侧的孵育方法中，抗体极易从膜上流出，从而使得转移有蛋白印迹点的膜干燥，影响免疫印迹的实验结果。Canzler等研发了只需100μl或更少量的稀释后的抗血清的微小印迹方法(Canzler et al.，2009a；Canzler et al.，2009b)。该方法对使用有限的样品利用不同的抗体同时检测不同的蛋白表达时非常有用，但是操作过程更为复杂，对于常规的免疫印迹检测而言，该方法既不经济也不简便。虽然不同实验中未与抗原结合的剩余抗体可以反复利用，但是重复使用的抗体中有效抗体的数量和质量却很难度量和控制，在实验中应用这些抗体降低了对免疫印迹的结果的预测和控制。

参考文献

Canzler，U.，Bartsch，H.，Grossmann，K.，Lehmann，W.，Conrad，K.，Kurien，B.T.，Dorri，Y.，Scofield，R.H.，Bachmann，M.，2009a.A miniaturized blotting system for simultaneous detecting of different autoantibodies.Methods Mol.Biol.536，129-137.

Canzler，U.，Bartsch，H.，Ulitzsch，S.，Kurien，B.T.，Dorri，Y.，Scofield，R.H.，Grossmann，K.，Lehmann，W.，Pilarsky，C.，Denz，A.，Grutzmann，R.，Conrad，K.，Schmitz，M.，Rieber，E.P.，Distler，W.，Bachmann，M.P.，2009b.Detection of autoantibodies to tumour-associated antigens in sera of patients with systemic autoimmunity using a novel protein microblot array.Scand.J.Immunol.69，563-569.