[发明专利]农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.愈伤组织诱导：取竹种子成熟胚置于愈伤组织诱导培养基MS2上培养2-3周后，获得愈伤组织，3-4周后，获得竹胚性愈伤组织；

b.预培养：将处于诱导后期的竹胚性愈伤组织转接至新鲜的愈伤组织诱导培养基MS2中预培养1周；

c.含有目的基因农杆菌的活化与重悬：挑取含有目的质粒的农杆菌，在含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的农杆菌培养基YEB上划线，在28℃培养箱中培养两天；挑取单菌落于另一新鲜的含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的农杆菌培养基YEB上继续培养两天；在超净台中刮取农杆菌培养基YEB平板上的农杆菌于诱导液中重悬混匀，使OD600接近0.2；

d.侵染和共培养：取经过预培养的竹胚性愈伤组织于诱导液中振荡30min，取出竹胚性愈伤组织，在无菌滤纸上吸干水分，然后在含有乙酰丁香酮的共培养培养基上共培养两天；

e.筛选抗性愈伤组织：取出竹胚性愈伤组织转接至含有75mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的抗性筛选培养基上筛选抗性愈伤组织；

f.丛生芽分化和伸长：将筛选到的抗性愈伤组织转入丛生芽分化培养基，诱导丛生芽；

g.伸长丛生芽根的诱导：取健壮丛生芽幼苗直接转入生根培养基生根；幼苗在生根培养基中生长15-20天，诱导生根，获得再生小植株；

h.转化植株鉴定：用PCR方法对上述获得的再生小植株进行检测，确定外源基因已经整合到竹子基因组DNA中，确定转化小植株；

i.幼苗移栽：将上述转化小植株洗净培养基，移入营养钵中，利用人工喷水保持环境湿度，经过驯化炼苗20-30天后，移栽入装有花园土、直径为30cm的花盆中。

2.根据权利要求1的农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法，其特征在于，所述的步骤a、b中，

愈伤组织诱导培养基MS2的配方为：MS+2，4-D 2mg/L+KT0.2mg/L+IBA0.4mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.6-5.8；

所述的步骤c中，农杆菌培养基YEB的配方为：细菌蛋白胨5g/L，酵母浸膏1g/L，牛肉浸膏5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.04g/L，琼脂16g/L，pH7.0；

诱导液为：MS2，麦芽糖30g/L，pH5.6-5.8；

所述的步骤d中，

诱导液为：MS2，麦芽糖30g/L，pH5.6-5.8；

共培养培养基的配方为：MS2，乙酰丁香酮14.7mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.6-5.8；

所述的步骤e中，

抗性筛选培养基的配方为：MS2，卡那霉素75mg/L，羧苄青霉素500mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.6-5.8；

所述的步骤f中，

丛生芽分化培养基的配方为：MS+KT2.5mg/L+IAA 0.5mg/L，卡那霉素75mg/L，羧苄青霉素500mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.6-5.8；

所述的步骤g中，

生根培养基的配方为：MS+NAA0.25mg/L+IBA 0.4mg/L，羧苄青霉素500mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH5.6-5.8；

所述的步骤i中，

营养钵中的配方为：腐叶土∶石英砂∶土壤＝2∶1∶1；

培养条件为：昼温度25℃，夜温度18℃，光照时间14h/d。