[发明专利]利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌的检测方法，尤其涉及一种利用生物免疫测定技术检测大肠杆菌的方法。

背景技术

大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，人们才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症。大肠杆菌是一种普通的原核生物，属于细菌，根据不同的生物学特性，我们可以将具有致病性的大肠杆菌分为五类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。这几类大肠杆菌是重要的食源性病原菌，主要通过受污染的食物(饮用水、肉制品和原料奶等)向人类传播。迄今为止，全球已发生过多起因感染具有致病性大肠杆菌(例如E.coli O157:H7)而集体死亡的事件。因此，快速、灵敏的检测大肠杆菌(例如E.coli O157:H7等)对预防这类事件的再次发生具有非常重大的意义。

目前，大肠杆菌的检测技术主要包括利用单克隆抗体的直接检测技术以及大肠杆菌特征性核酸片段的分子生物学检测技术，常用的直接检测方法主要有利用单克隆抗体的ELISA(enzyme linked immune sorbent assay)反应检测、荧光染料探针标记检测、化学发光微阵列检测、压电石英晶体传感检测等，而分子生物学检测方法主要有基因探针方法、荧光实时PCR方法等。相对于分子生物学检测技术来说，单克隆抗体用于检测大肠杆菌的直接检测技术具有明显的特异性，并可较大程度地避免假阳性，其作为一种免疫试剂在临床和食物标本的快速检测中具有广泛的应用前景。但是，利用单克隆抗体直接检测的一些信号识别方法(如ELISA方法或荧光染料探针方法)已不能满足高灵敏检测的需求，因此，探求准确、快速、灵敏地检测大肠杆菌的方法一直为医学界所关注。

磁纳米颗粒为一种处于纳米级(1nm～100nm)的磁性材料(Fe的氧化物为主)，其特质使其具备有量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应及宏观量子隧道效应等。当磁纳米颗粒粒径小于其超顺磁性临界尺寸时，粒子进入超顺磁状态，其表面可结合多种生物功能分子，结合后的磁纳米颗粒在微生物检测、基因治疗等医学领域都有广泛的应用。

流式细胞术(FCM)是利用流式细胞仪对细胞或其他微小生物颗粒的多种物理、生物学参数同时进行定量分析的技术，它能在单细胞水平辨认细胞形态、大小和荧光特征，具有检测速度快、采集数据量大、能同时进行多参数检测、方法灵活客观等优良特性，目前已成为一种重要的细菌检测手段，并应用于环境、食品以及生物医学等相关领域。然而，由于细菌体积微小、各种菌体成份含量相对较低，因此采用流式细胞术来实现对大肠杆菌的快速、高灵敏检测既是一种机遇，同时也是一种挑战。例如，利用传统荧光染料作为标记物，其荧光强度已难以满足高灵敏检测的需要，需要发展更明亮的荧光标记物。近年来，各种发光纳米颗粒，包括量子点、荧光乳胶颗粒以及二氧化硅荧光纳米颗粒等，由于具有更高的荧光强度和更好的光稳定性而成功地应用于生物标记及病原菌检测等领域，这些发光纳米颗粒标记技术为采用流式细胞术来实现对细菌的高灵敏检测提供了一种新的思路。然而，在细菌浓度较低的情况下，要克服假阳性信号等问题，从而达到快速、准确地检测要求仍然存在一定困难。因此，如何对低浓度的待测大肠杆菌样品进行快速、准确、灵敏地检测，对于本领域技术人员来说仍然具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种更加快速、准确、灵敏、且假阳性率低的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法。