[发明专利]一种猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因及制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于动物传染病技术领域，具体涉及一种分泌核酸酶SsnA基因的分离和克隆，将所述的基因通过大肠杆菌表达，获得重组大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/PET28a-SsnA)，利用该菌株表达猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA，并建立酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别诊断方法，用于区分猪链球菌2型灭活疫苗免疫猪与感染猪。本发明提供含有猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA的表达质粒(pET-28a(+))、重组大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/PET28a-SsnA、SsnA蛋白的表达和纯化方法以及用该蛋白建立的可区分猪链球菌2型灭活苗免疫猪血清和感染猪血清的鉴别诊断方法。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是引起猪链球菌病的主要病原，依据猪链球菌表面的荚膜多糖(CPS)可以将S.suis分为35个血清型，分别为1/2型和1～34型，但最近也有人提出32型和34型应该归于Streptococcus orisratti，而不应该归于猪链球菌。在猪链球菌35个血清型中，猪链球菌2型(SS2)是流行最广的病原(Hill J.et al.，2005)。该型亦是临床分离频率最高的血清型。SS2是一种重要的人畜共患病病原体，能引起猪脑膜炎(meningitis)、心内膜炎(endocarditi)、败血症(septicemia)、关节炎(arthritis)、浆膜炎(polyserositis)、肺炎(pneumonia)等，常引起断奶仔猪或育肥猪突然死亡；人类感染该菌，可导致脑膜炎，引发永久性耳聋、败血症、心内膜炎，甚至死亡(Vecht U et al.，1985；Clifton-Hadley FA，1983；Gottschalk M et al.，2000)。我国于1991年在广东省首次报道了该病的发生。1998-1999年夏季在我国江苏省部分地区猪群中暴发流行，并导致特定人群致死的疫病由猪链球菌2型所引起。2005年夏季，四川省多个地区发生猪链球菌2型病疫情，造成500多头生猪死亡，人感染200多例，死亡30多例，进一步证实该病已在我国开始广泛流行。

由于对猪链球菌的致病机制还不清楚，无有效的检测和诊断方法，在很多国家猪链球菌一直未得到有效的控制。特别是对猪链球菌抗体检测的方法国内外一直无商品化的试剂盒，对于感染和免疫无法进行有效的区分。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其第一个目的是分离和克隆猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因片段。其第二个目的是利用所克隆的分泌核酸酶SsnA基因片段转化大肠杆菌，获得一种能特异性表达该分泌核酸酶SsnA的重组大肠杆菌。本发明的第三个目的是获得一种蛋白，为猪链球菌2型的检测诊断试剂盒和ELISA方法提供一种新抗原。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过基因克隆方法，从猪链球菌2型中分离克隆得到一种分泌核酸酶SsnA基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列长度为1131bp，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，包含377个氨基酸。将所述的分泌核酸酶SsnA基因片段转化大肠杆菌，获得一种包含猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因并能表达该基因的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/PET28a-SsnA，将该重组大肠杆菌于2010年6月24日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：M2010155。

1、重组大肠杆菌的制备步骤：

1)以猪链球菌2型(Streptococcus suis2，SS2)基因组为模板，设计引物对，通过PCR方法扩增得到猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因；该基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

2)将猪链球菌2型分泌核酸酶基因SsnA基因插入原核表达载体pET-28a(+)(购自Novagen公司)的BamHI和XhoI多克隆位点，构建得到中间表达质粒pET28a-SsnA；

3)将步骤2)的中间表达质粒pET28a-SsnA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，用卡那霉素抗性筛选单个重组大肠杆菌，经诱导(见后面的详细过程所述)得到特异性地表达分泌核酸酶基因SsnA蛋白；

其中步骤1)所述的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：P15’-GTGGGATCCACTGAAGTGGCGATA-3’，