[发明专利]一种简单高效的青蒿遗传转化体系

说明书

所属技术领域

本发明涉及生物技术中的遗传转化领域，具体是一种简单高效的植物青蒿遗传转化体系的构建方法。

背景技术

中药青蒿，即黄花蒿(Artemisia annua L.)又名臭蒿，臭青蒿，为菊科蒿属一年生草本植物。从青篙中提取的青篙素及其衍生物是继喹啉类和吖啶类之后的一类新的抗疟药物。上世纪80年代初发现青蒿素具有抗血吸虫作用，此外，青蒿类药物还具有抗肿瘤、免疫调节、抗心律失常等作用。世界青蒿素药物生产主要依靠我国从青蒿中提取，过去主要利用野生青蒿资源，人工栽培很少，近年来由于需求量越来越大，野生中药青蒿资源日益枯竭，必须依靠人工栽培种植，而人工栽培青蒿素品种青蒿素含量普遍较低，提高栽培品种的叶片产量与青蒿素含量是当前青蒿育种的主要目标。当前植物遗传转化技术的发展为人类改良植物品种带来了前所未有的速度和能力，在短时间内实现改良植物品种的产量、质量取得了明显的效果，通过基因工程获得转基因青蒿高产株系是提高青蒿素产量的最有潜力的途径之一。

植物遗传转化始于20世纪70年代，30多年来，植物基因工程取得长足发展，转基因作物在生产上大面积推广应用。目前，植物遗传转化最常用的两种方法是农杆菌介导法和基因枪法，转化的受体组织可以是愈伤组织、原生质体等分离细胞，也可以是完整的植物细胞。这些转化方法有以下不足：(1)依赖于组织培养，操作复杂，操作者需要有较好的专业知识基础和经验；(2)过多的处理常引起受体组织的突变，影响转化的目的性和真实性；(3)转化植株中常出现基因沉默，从而大大降低目的基因的表达效率。因此，在许多植物遗传转化中，转化效率低、操作周期长严重制约着分子育种和基因功能研究。目前，在拟南芥等模式植物的研究中，非组培方法已成为遗传转化的主要手段，这些方法在其它植物中也有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单高效的青蒿遗传转化体系，提高转基因植株的得率。

本发明解决问题所采用的技术方案是：一种简单高效的青蒿遗传转化体系，其构建方法包括步骤如下：

1)青蒿植株的栽种；

2)转化液的配制；

3)转化菌的培养；

4)植株遗传转化；

5)转化植株筛选；

所述青蒿植株的栽种包括：青蒿种子于先年11月中旬播种于黑壤土∶蛭石∶细沙(4∶2∶1)的混合土中，盆栽，第二年2月，放于温室中，温度20～22℃，相对湿度60％～70％，光照16h，黑暗8h，培养约2个月后，放于室外，长至茎高100cm左右时，去其顶生花序，继续生长3～5d后，即可用于转化；

所述转化液的配制：是按照要求配制转化液，所述转化菌的培养：从加有卡那霉素的农杆菌培养基上，挑取阳性农杆菌接种于含利福平和卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220r/m振荡培养至OD600为1.2～1.8(约需48h)，离心弃上清，收集菌体重悬于转化液中；

所述植株遗传转化包括：将准备好的植株倒置于含转化缓冲液的塑料桶中，套黑色塑料袋避光放置24h，然后按常规方法培育植株至结实，收获成熟种子；

所述转化植株筛选：将得到T₀代种子，经选择培养基筛选，得到阳性植株，提取阳性植株DNA，通过PCR技术对阳性植株进行进一步鉴定；

本方法还可以包括T1代表型鉴定：根据转入基因特点，对T1代转基因植株进行表型鉴定。

本方法中所述的转化液每1000ml中包括：1/2MS大量元素(50×)10ml，1/2MS微量元素(50×)10ml，蔗糖30g，乙酰丁香酮(40mg/ml)0.1ml，6-BA(40mg/ml)，10μl，表面活性剂Silwet L-77，1ml；

本发明通过农杆菌介导，将带目标基因的转化液直接浸泡花蕾的方法，将从青蒿中克隆的ipt基因转入青蒿中，转化成功率为5％-8％，检测发现ipt基因在青蒿高产株系中能过量表达，转基因青蒿中ipt的酶活性是非转基因青蒿的3-4倍，导致转基因植株分蘖数明显增加；转基因植株中青蒿素含量最高可达0.92％(DW)，是非转基因青蒿中青蒿素含量的1.42倍。