[发明专利]一种联苯双加氧酶在降解多氯联苯中的应用

说明书

技术领域

本发明属微生物基因工程领域，具体涉及一种联苯双加氧酶在降解多氯联苯中的应用。

背景技术

多氯联苯(Polychlorinated biphenyls)是一类持久性有机污染物(Persistentorganic pollutants，简称POPs)，对自然生态系统和人类健康都有一定的危害作用。多氯联苯作为一类分布广，污染量较大的持久性有机污染物，对环境存在着很大的潜在危害。修复多氯联苯对环境的污染已经愈显重要，目前主要有非生物降解和生物降解两种方法。尽管目前多氯联苯降解的方法很多，但是大多数处于实验阶段，尤其是生物降解法，前景很大，但是还有很长的一段路要走。而非生物降解法虽然有不少缺点，但是实际操作和工业化生产中已有很大的应用，如果在此基础上进行合理的改革和创新，相信可以对多氯联苯和其它相关环境污染物的治理和修复起到很大的作用。我国对多氯联苯污染研究还较少，需要加强这方面技术的研究探索。

生物降解法主要是指微生物修复法和植物修复法。1973年首次报道微生物具有降解多氯联苯的能力，且多氯联苯分子上氯原子数目影响微生物的降解效率【Ahmed和Focht，Can J Micro，1973，19：47-52】。后续研究证实苯环上氯原子的个数增加会阻碍多氯联苯的降解以及氯原子在苯环上的位置也会影响降解效率。微生物法还可以进一步分为无机化和共代谢两种。无机化即在好氧或厌氧条件下以多氯联苯为碳源或能源，降解多氯联苯满足自身的生长和繁殖的需要。共代谢是指微生物不以多氯联苯污染物为碳源，但是一样可以达到转化污染物的目的【Borjia等，Process Biochem，2005，40：1999-2013】。除了细菌，部分真菌也能降解低浓度的多氯联苯，但是降解效率相对较低【Kamei等，Appl Microbiol Biotechnol，2006，73：932-940】。植物体修复多氯联苯主要有直接修复和体外修复两种，即直接吸收土壤中多氯联苯或者释放酶等物质在体外对多氯联苯进行降解。植物-微生物联合降解法是目前研究的一个热点，如紫花苜蓿-菌根真菌-根瘤菌联合法对多氯联苯污染土壤的修复效果较好，该法较单独某种降解法效率更高【崔力拓等，农业环境科学学报，2008，27(1)：226-229】。另外，植物转基因也为生物降解多氯联苯提供了新的方法【Sylvestre等，Curr Opin Biotechnol，2009，20：242-247】。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种联苯双加氧酶在降解多氯联苯中的应用，本发明方法可用于制备降解多氯联苯微生物基因工程菌。

一种联苯双加氧酶降解多氯联苯的方法，具体包括以下步骤：

首先，构建偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因的荧光假单胞菌表达基因载体；其次，使含有该偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶的表达基因载体荧光假单胞菌遗传转化；最后，对所得转化子降解二羟基联苯的结果进行测定。

所述方法可用于制备降解多氯联苯微生物基因工程菌。

所述方法在降解多氯联苯中的应用。

有益效果：

本发明通过构建偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因的荧光假单胞菌表达载体，并在荧光假单胞菌中成功表达并降解二羟基联苯。本发明表明构建荧光假单胞菌表达载体能够显著提高荧光假单胞菌的降解能力。

附图说明

图1为荧光假单胞菌表达载体酶切鉴定电泳图，其中A为Pfb1690载体，B为二羟基联苯双加氧酶基因。

图2为转化子降解二羟基联苯的测定结果，其中B为二羟基联苯双加氧酶基因。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和荧光假单胞菌(Pseudomonas putida)EG11由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。

克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、连接酶、dNTP、10×PCRbuffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。

表达载体所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。

ABI PRIAM Bio-DyeTerminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。带有pGM启动子和t1t2终止子的荧光假单胞菌表达载体pFB1690由上海市农业科学院生物技术研究所基因工程研究室构建。