[发明专利]家蚕核型多角体病毒39k诱导型启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus，BmNPV)39k诱导型启动子及其应用。

背景技术

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫。BmNPV是蚕业生产上最常见且危害最严重的一类病原，对蚕业影响巨大。如何利用当今发展迅速的基因工程技术，从根本上提高家蚕病毒抗性，是蚕业领域重要的研究课题。基因敲除研究表明，缺失某些增殖必需基因，BmNPV将不能增殖。因此，抑制这些病毒增殖必需基因的表达将成为防治家蚕感染BmNPV的一种有效策略。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指外源性双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发生物体内同源mRNA降解从而表现出的基因转录后沉默现象，现已成为分子生物学家分析基因组功能和基因治疗的一个有力工具。小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是RNAi的效应分子，是一类长21～23个核苷酸的双链RNA，在体内可特异性降解与其序列互补的mRNA而引发RNA沉默。产生siRNA的方法有多种，其中化学合成法简单易行，但由于siRNA的稳定性较差，在体内易被核酸酶降解，RNAi干扰效应时间短，因而分子生物学家多采用siRNA表达载体法，即将短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)对应的DNA模板序列插入载体启动子后构建RNAi载体，RNAi载体导入体内后持续转录出shRNA，shRNA被RNaseIII家族的内切核酸酶Dicer剪切成siRNA，从而引发较长时间的RNA沉默效果。因此，利用RNAi技术，以BmNPV增殖必需基因为靶标构建RNAi载体，再将其导入家蚕细胞并持续表达能够导致BmNPV增殖必需基因mRNA降解的siRNA，是防治家蚕感染BmNPV和培育家蚕抗病毒品系的有效手段。

近年来，研究者先后利用T7启动子，3XP3启动子及IE-1启动子等组成型启动子来构建以BmNPV增殖必需基因为靶标的RNAi载体。虽然这些启动子能够诱发较高的RNAi效率，但外源基因的组成性表达会对转基因家蚕的发育和健康造成一定负面影响。根据杆状病毒基因转录的级联模式，延迟早期基因的转录依赖于反式激活因子的基因产物，如果在构建RNAi载体时选择由病毒感染所诱导的诱导型启动子，则有望在病毒感染时迅速提高siRNA表达水平，减少外源基因组成性表达的负荷，提高转基因家蚕的健康性。但迄今为止，尚未见有关BmNPV诱导型启动子的研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种BmNPV诱导型启动子，具有明显的BmNPV诱导启动活性，能使细胞在受到BmNPV感染时启动外源基因的表达；目的之二在于提供含有所述诱导型启动子的重组表达载体；目的之三在于提供含有所述重组表达载体的转化体；目的之四在于提供所述诱导型启动子的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、BmNPV 39k诱导型启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2、含有所述BmNPV 39k诱导型启动子的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体是以BmNPV增殖必需基因为靶标的RNAi载体，所述RNAi载体包含由BmNPV 39k诱导型启动子控制表达的shRNA，所述shRNA与BmNPV增殖必需基因的mRNA具有同源性。

3、含有所述重组表达载体的转化体。

4、所述BmNPV 39k诱导型启动子在家蚕抗BmNPV品系的基因工程育种中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种BmNPV 39k诱导型启动子，具有明显的BmNPV诱导启动活性，能使细胞在受到BmNPV感染时启动外源基因的表达。利用本发明的启动子和shRNA可以构建以BmNPV增殖必需基因为靶标的RNAi载体，在家蚕遭受BmNPV感染时高丰度表达shRNA，shRNA在胞内被酶剪切成siRNA，特异性降解BmNPV增殖必需基因的mRNA，从而引发BmNPV增殖必需基因的转录后沉默，达到抑制病毒增殖的目的，可用于家蚕感染BmNPV的防治以及家蚕抗BmNPV品系的基因工程育种，同时也可为其他生物病毒病的转基因治疗提供了很好的参考模式。由于BmNPV只感染昆虫，因此，本发明的BmNPV 39k诱导型启动子对人畜及植物安全无害。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：