[发明专利]一种同步检测多种烟草病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及一种同步检测多种烟草病毒的方法。

背景技术

烟草是全世界最主要的经济作物之一，我国的种植面积居世界首位。然而，随着产业的发展，种植面积的扩大与产业结构调整，20世纪70年代以后，烟草病毒病危害逐年加重。由于病毒的侵染，烟草叶绿素的受到破坏，从而导致了光合作用的下降，严重影响烟叶的产量和质量，造成重大的经济损失。

危害我国烟草的主要病害有烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus，CMV)、马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)、烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)和烟草脉带花叶病毒(Tobaccovein banding mosaic Virus，TVBMV)等。其中TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV是引起烟草病毒病的主要病毒。

对危害烟草的病毒进行准确和快速检测诊断，在预防和控制烟草病毒病具有十分重要的意义。然而，目前检测烟草病毒的主要方法有指示植物法、电镜法、血清学法以及普通PCR技术。这些检测方法主要是针对单个病毒检测，费时费力。

多重PCR(M-PCR)是在普通PCR(polymerase chain reaction)的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。与常规的单一PCR相比，多重PCR可以同时检测多种病害，极大地提高检测效率，降低检测成本。目前国内仅有单重PCR检测TMV、CMV等的报道，而在田间经常表现为多种病害复合侵染，利用单一PCR对多种病毒进行系统检测的工作量较大，因而多重PCR在烟草病毒病的检测中的优越性更为明显。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种同步检测2-5种烟草病毒的方法，该方法包括烟草病毒总RNA的提取，多重RT-PCR和电泳检测，确定病毒种类，其中烟草病毒选自烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)中的2-5种，其中多重RT-PCR反应中应用的引物为包含如下5对引物中的2-5对引物的引物组，优选地，引物组中包含如下5对引物：

第1对引物：

SEQ ID NO.1：5′-TAGACCCGCTAGTCACAG-3′(正向序列)

SEQ ID NO.2：5′-CAGAGGTCCAAACCAAAC-3′(反向序列)

第2对引物：

SEQ ID NO.3：5′-GTGGGTGACAGTTCGTAAA-3′(正向序列)

SEQ ID NO.4：5′-GTGGGAATGCGTTGGT-3′(反向序列)

第3对引物：

SEQ ID NO.5：5′-TGATGGATGGTGAGGAG-3′(正向序列)

SEQ ID NO.6：5′-GTGCCGTTCAGTGTCTT-3′(反向序列)

第4对引物：

SEQ ID NO.7：5′-CCGAGAATCAAGGCTATC-3′(正向序列)

SEQ ID NO.8：5′-CGCTAAACCTACATCCC-3′(反向序列)

第5对引物：

SEQ ID NO.9：5′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′(正向序列)

SEQ ID NO.10：5′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′(反向序列)

上述方法中，检测病毒的种类和引物对种类选择的对应关系是：

TMV对应第1对引物

CMV对应第2对引物

TEV对应第3对引物

PVY对应第4对引物

TVBMV对应第5对引物

也就是当需要检测烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的时候，需要引物组包含第1对和第2对引物，引物组中可以包含其他引物对，但是至少要包含第1对和第2对引物。

具体地，上述同步检测2-5种烟草病毒的方法包括如下步骤：

1)病毒总RNA的提取：

提取感染2-5种病毒的烟草叶中的病毒总RNA；

2)多重RT-PCR：