[发明专利]基于昆虫杆状病毒表达系统的重组人神经生长因子的制备方法

权利要求书

1.一种基于昆虫杆状病毒表达系统的重组人神经生长因子的制备方法，其步骤是：

(1)将编码人神经生长因子的基因可操作地连接于表达载体Bacmid，构建表达人神经生长因子的重组表达载体；

(2)所述重组表达载体转染昆虫细胞，收获重组病毒颗粒，构建表达人神经生长因子的昆虫表达系统；

(3)培养昆虫细胞，并用重组病毒感染，获得大量重组人神经生长因子。

2.如权利要求1所述基于昆虫杆状病毒表达系统的重组人神经生长因子的制备方法，其特征是：所述步骤(1)的方法是：

(1.1)将人神经生长因子基因片段用BamHI、HindIII双酶切后插入pFastBac^TMDual质粒，构建pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]重组质粒，转化大肠杆菌JM109菌株，筛选重组子，提取pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]重组质粒，经PCR与酶切鉴定插入正确后，测序验证其序列正确性；

(1.2)将上述鉴定正确的pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]质粒转化含有Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，挑取阳性克隆，获取含重组人神经生长因子基因的穿梭质粒Bacmid+[rhβ-NGF]，经PCR鉴定后再经测序验证其序列正确性；

所述人神经生长因子基因片段是：

ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACAGCTTTTCTGATCGGCATACAGGCGGAACCACACTCAGAGAGCAATGTCCCTGCAGGACACACCATCCCCCAAGCCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCTTGACACTGCCCTTCGCAGAGCCCGCAGCGCCCCGGCAGCGGCGATAGCTGCACGCGTGGCGGGGCAGACCCGCAACATTACTGTGGACCCCAGGCTGTTTAAAAAGCGGCGACTCCGTTCACCCCGTGTGCTGTTTAGCACCCAGCCTCCCCGTGAAGCTGCAGACACTCAGGATCTGGACTTCGAGGTCGGTGGTGCTGCCCCCTTCAACAGGACTCACAGGAGCAAGCGGTCATCATCCCATCCCATCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACATCAAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAAGTGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGACTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA

氨基酸序列是：

MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARYAGQTRNITYDPRLFKKRRLRSPRYLFSTQPPREAADTQDLDFEYGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSYCDSVSYWYGDKTTADIKGKEVMVLGEYNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWBSTCTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACYCYLSRKAYRRA-

3.如权利要求2所述基于昆虫杆状病毒表达系统的重组人神经生长因子的制备方法，其特征是：构建pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]重组质粒的方法是：在构建pFastBac^TMDual质粒后，利用T₄DNA ligase连接构建得到pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]重组质粒。

4.如权利要求1所述基于昆虫杆状病毒表达系统的重组人神经生长因子的制备方法，其特征是：所述步骤(2)的方法是：

(2.1)取对数生长期的昆虫细胞sf9，用含rhβ-NGF的穿梭质粒Bacmid和脂质体转染试剂cellfection2000混合进行转染；

(2.2)转染后的sf9细胞因Bacmid+[rhβ-NGF]质粒的表达而产生昆虫病毒颗粒，并使sf9细胞裂解；

(2.3)收获细胞培养上清，其中含有携带重组人神经生长因子的昆虫杆状病毒颗粒及少量重组人神经生长因子。