[发明专利]同源四倍体天山雪莲植株的培育方法

权利要求书

1.一种同源四倍体天山雪莲植株的培育方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、将天山雪莲种子用温水浸泡20min，再用75％乙醇表面消毒20-50sec，然后用15％H₂O₂溶液消毒15-50min，将消毒后的种子用无菌水漂洗2-5次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种10-30粒种子，7-15天后雪莲种子即可萌发产生无菌苗；

b、将步骤a中萌发生长的无菌苗切除其根部和叶片，保留下胚轴茎段部分；

c、将步骤b中下胚轴茎段接种于添加有2％二甲基亚砜和浓度为0-0.20％秋水仙素的出芽诱导培养基上处理1-3d，培养温度25-30℃，光照强度50μmol·m^-2·s^-1，光照时间16h·d^-1，出芽诱导培养基为MS+BA0.3-0.5mg/L+TDZ0.3-0.5mg/L+NAA0.05-0.1mg/L；

d、将步骤c中处理过的下胚轴茎段转入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖培养基中培养25-30d，培养温度20±1℃，光照强度50μmol·m^-2·s^-1，光照时间16h·d^-1；

e、将步骤d中增殖的苗切成单芽后转接至1/2MS+NAA0.05-0.2mg/L生根培养基中生根；

f、天山雪莲同源四倍体的筛选：将步骤e中的植株与二倍体对照植株做对比分析，根据二者在外观形态如叶片宽度、叶面积以及解剖结构上气孔保卫细胞的大小和密度之间的差异，初步确定为同源四倍体植株；

g、天山雪莲同源四倍体的鉴定之一：随机剪取步骤e中植株的幼嫩根尖和幼嫩不定芽茎尖组织，在温度0-4℃，经过0.002mol/L 8-羟基喹啉预处理或饱和对二氯苯水溶液预处理，卡诺固定液固定，温度60℃，1-2mol/L盐酸解离6-15min，改良苯酚品红染色液染色10-15min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽茎尖染色体，初步确定为同源四倍体植株；

h、天山雪莲同源四倍体的鉴定之二：随机剪取步骤e中部分植株的叶片，于常温下在装有3-5ml细胞核提取缓冲液的培养皿中用剪刀将其剪碎，200目尼龙网过滤，500-1000r·min^～1离心漂洗3次，流式细胞仪检测确定为同源四倍体植株；

i、天山雪莲同源四倍体的移植：将步骤e中培育的植株洗去根部附着的残留培养基，定植于草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1的温室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通风一次，每次30min，每两天浇水一次，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期浇水，温室培养，天山雪莲同源四倍体植株炼苗移栽成活率达82％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c、d和e中的培养基均为固体培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤g中8-羟基喹啉预处理时间为2-6h，饱和对二氯苯水溶液预处理时间为5-10h，卡诺固定液固定时间为12-36h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤i温室苗床湿度为60％，温室培养温度控制在20-22℃。