[发明专利]一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因工程亚单位疫苗，特别涉及一种产肠毒素大肠杆菌(ETEC)多价肠毒素免疫原，用于预防和治疗由ETEC等细菌引起的腹泻。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)可引起幼龄动物(包括仔猪、犊牛、羔羊等)的急性、传染性腹泻，严重危害畜牧养殖业的健康发展，并且造成巨大的经济损失。ETEC还是发展中国家婴幼儿及旅游者腹泻的主要病原体，全球每年因ETEC感染的腹泻病例高达6.5亿人次，导致约38万5岁以下儿童死亡(Sizemore等，2004年，Expert Rev.Vaccines)。

ETEC引起腹泻发生的作用机理是：细菌首先借助其表面的菌毛等黏附素定植于小肠粘膜上皮细胞上，进而在肠道内大量繁殖并产生肠毒素，作为直接致病因子的肠毒素使肠上皮细胞代谢紊乱，分泌大量水分和电解质进入肠腔，最终导致腹泻的发生。ETEC的菌毛种类繁多，动物来源菌株的菌毛，较重要的有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F18、F41等；人源ETEC的菌毛更多，已鉴定的超过25种。但是ETEC分泌的肠毒素只有两种，不耐热肠毒素LT和耐热肠毒素ST，ST分为STa和STb两个亚型。

对于ETEC性腹泻的治疗，生产中主要应用抗生素及化学药物。但控制此病的关键在于预防，预防的方法除了保持卫生、消毒环境外，主要使用疫苗免疫预防。目前商品化的ETEC疫苗有全菌灭活疫苗，菌毛亚单位疫苗和类毒素疫苗。以下列举获得我国农业部兽药产品批准文号的4个疫苗，它们是在生产实践中使用的兽用大肠杆菌疫苗的典型代表：

(1)羊大肠埃希氏菌病灭活疫苗，黑龙江省生物制品一厂，兽药生字(2006)080074009。

(2)仔猪大肠杆菌三价灭活疫苗，齐鲁动物保健品保健公司，兽药生字(2006)150251028。

(3)仔猪大肠杆菌病K88/K99双价基因工程灭活疫苗，上海海利生物药品有限公司，兽药生字(2007)090201027。

(4)仔猪大肠杆菌病K88、LTB双价基因工程活疫苗，中牧实业股份有限公司江西生物药厂，兽药生字(2008)140401025。

不耐热肠毒素LT由两个亚基组成，A亚基(LTA)是毒性中心，B亚基(LTB)是一个五聚体结构，没有毒性且有良好的免疫原性，常常被用作疫苗的成分。耐热肠毒素STa和STb是分子量很小的半抗原，缺乏免疫原性，若直接用全菌灭活疫苗免疫无法诱导机体产生针对STa和STb的中和抗体。为了解决这一问题，可以将耐热肠毒素STa或STb偶联到大分子的载体蛋白上，使它们具备免疫原性(I.Klipstein等Development of a vaccine of cross-linked heat-stable andheat-labile enterotoxins that protects against Escherichia coli producing eitherenterotoxin.Infect.Immun.1982，37(2)：550-557.II.Dubreuil等A recombinantEscherichia coli heat-stable enterotoxin b(STb)fusion protein eliciting neutralizingantibodies，FEMS Immunol.Med.Microbiol.1996，13：317-323.)。

虽然ST是导致腹泻发生的重要致病因子，但由于天然STa和STb分子没有免疫原性，现在上市的疫苗产品都不含有ST成分。在已知的现有技术中，为了制备有效的STa或STb类毒素，研究人员还构建了下列融合亚单位疫苗：

①LTB-STa二价融合肠毒素(张兆山等，不耐热肠毒素和耐热肠毒素基因的融合.中华微生物学和免疫学杂志，1994，14(04)：219-222.)

②STa-LTB二价融合肠毒素(许崇波等，大肠杆菌肠毒素ST1-LT-B融合基因的构建.中国兽医学报，1998，18(05)：463-465.)

③K88ac-ST1-LTB三价融合肠毒素及菌毛蛋白(许崇波等，表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究.中国预防兽医学报，2003，25(01)：9-12.)

④LTB-STa-STb三价融合肠毒素(葛艳等，产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、ST I和ST II融合基因的构建与表达研究.中国预防兽医学报，2002，24(05)：27-29.)