[发明专利]光学活性苯基环氧丙醇及其衍生物的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，公开了一种含有苯乙烯单加氧酶基因的大肠杆菌E.coli(pETAB)菌株全细胞选择性催化(S)-1-苯基-2-丙烯醇及其衍生物的不对称环氧化，制备光学活性(1R，2R)-1-苯基-2，3-环氧丙醇及其衍生物。

背景技术

光学纯缩水甘油类化合物是合成β-受体抑制剂药物的重要中间体，近年来该类化合物的合成方法研究有了较大的发展。其中Sharpless不对称环氧化是化学催化的重要方法(Martin V.-S.，et al.Sharpless Kinetic resolution of racemic allylic alcohols by enantioselective epoxidation.A route to substances of absolute enantiomeric purity？J.Am.Chem.Soc.，1981，103(20)：6237-6240)，该方法可以得到光学纯缩水甘油类化合物，但是该催化反应过程需要金属催化剂，增加了生产成本，产物中也会残留金属，而且合成过程中伴随大量的有机试剂，对环境造成了严重的污染。近年来，生物催化方法已经广泛应用到该类化合物的合成研究。在生物催化过程中没有金属催化剂和大量有机溶剂的使用，是一个相对绿色的合成方法。已报道利用脂肪酶lipase拆分消旋缩水甘油类化合物获得光学纯该类化合物(Takeshita M.，et al.Enzymatic preparation of chiral 1-phenylglycidols and 1-phenyl-1，2-propanediols.Tetrahedron：Asymmetry 1992，3(11)：1369-1372)。但由于此类化合物具有两个手性中心，因此产率仅为投入原料的1/4，这样极大地浪费资源，且该拆分步骤繁琐也不利于生产过程。通过寻找高效高选择性的酶，以消旋体为底物，同时构建两个手性中心，从而可以转化投入物料的1/2得到光学活性的缩水甘油类产物，大大提高对反应底物的利用。这是发展该类化合物的生物催化途径的有效方法之一。同时拆分残留的手性醇也是有机合成过程重要的合成中间体。

发明内容

本发明涉及苯乙烯单加氧酶催化不对称环氧化拆分过程，以(±)-1-苯基-2-丙烯醇及其衍生物为底物，以包含苯乙烯单加氧酶基因的大肠杆菌E.coli(pETAB)休止细胞全细胞为催化剂，得到光学纯(1R，2R)-1-苯基-2，3-环氧丙醇及其衍生物，并残留另一异构体(R)-1-苯基-2-丙烯醇及其衍生物。本发明涉及的苯乙烯单加氧酶催化不对称环氧化拆分过程对邻位手性羟基具有很高的选择性，该酶催化产生的环氧手性中心也有很高的对映选择性，因此可以转化投入物料的1/2得到光学活性的缩水甘油类产物，大大提高对反应底物利用。同时拆分残留的手性醇也是有机合成过程重要的合成中间体。

该发明可以用以下反应式来表示。

本发明采用专利“一种苯乙烯环氧化酶基因及其用途”所属的StyAB基因(吴中柳等，一种苯乙烯环氧化酶基因及其用途，申请号201010120969.4)，连入pET28(a)载体构建表达载体pETAB，转入大肠杆菌E.coli，构建E.coli(pETAB)，经培养细胞后，以全细胞为催化剂用于转化(±)-1-苯基-2-丙烯醇及其衍生物，得到光学纯(1R，2R)-1-苯基-2，3-环氧丙醇及其衍生物，并残留另一异构体(R)-1-苯基-2-丙烯醇及其衍生物。

具体的说，包括以下步骤：

1、细胞的获得：

根据专利“一种苯乙烯环氧化酶基因及其用途”描述的方法构建的表达菌株E.coli(pETAB)保存于LB平板上(卡那霉素抗性，50μg/ml)，挑取E.coli(pETAB)单菌落，在含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中于37℃，230rpm培养16h作为种子培养基，以1％接种量接种于TB培养基中，37℃振荡培养3h，而后降温至20℃诱导styAB基因表达，诱导18～21h后，4℃冷冻离心，收获菌体。

将收集的新鲜培养E.coli(pETAB)细胞重悬于浓度为0.1M、pH 5.5～8.0的磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液或Tris缓冲液，配成以湿重计细胞浓度为50～200g/L的菌悬液。以(±)-1-苯基-2-丙烯醇及其衍生物为底物，采用直接加入底物或将底物溶解于二甲亚砜(先配成质量浓度为30％～60％的母液)再加入到反应体系中，底物终浓度为0.5～3g/L，20～37℃、50～300rpm，反应2～48h。