[发明专利]一种静电纺丝固定化漆酶电极的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶电极的制备方法，及将该酶电极用于水中污染物检测的电化学检测领域。具体涉及一种用于检测水中污染物的酶电极的制作方法以及将所制备的酶电极应用于水中低浓度氯酚类物质的检测。

背景技术

固定化酶传感器集酶反应的专一性、固定化酶的长期稳定性、电化学分析快速灵敏的特点于一体，正日益引起人们的关注，许多有理论意义和实用价值的酶电极正在不断被开发出来。其在环境中的应用主要是对于酚类物质的检测。90年代就有学者使用漆酶和酪氨酸酶双酶体系修饰的玻碳电极共同用于酚类化合物的连续流分析。随后，有研究报道酪氨酸酶通过交联法被固定于3-巯基丙酸自组合单层膜上制备的酶电极可在连续流模式下同时测定10种酚类化合物。Wang和Hasebe使用八种交联剂将酪氨酸酶共价固定在氨基化的碳电极表面，其中戊二醛交联方法显示出好的灵敏度，操作稳定性以及储存稳定性，并且此法应用于儿茶酚和4-氯酚的检测显示出低的检测限以及重复利用性。Jarosz-Wilkolazka等研究发现基于来源于C.unicolor的漆酶修饰电极制备的生物传感器对于儿茶酚浓度的动力学变化响应迅速，可以被很好的应用于连续流模式下检测酚类化合物。Korkut等在不使用交联剂的情况下通过电聚合过程将辣根过氧化物酶固定于碳纳米管/聚吡咯纳米生物材料修饰的电极上，研究了生物传感器对18种酚类衍生物的线性范围、灵敏度和检测限，发现生物传感器对所测试的这些酚类衍生物都具有低的检测限，并且响应时间快(小于2s)。

目前，传统的酶固定化方法主要有：吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。吸附固定是最简单的方法，是通过氢键、疏水键和π-电子亲和力等物理作用力将酶直接固定于不溶性载体上的一种固定化方法。此方法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，但这种方法负载的酶与载体相互作用力弱、酶易脱落。共价结合时通过对电极进行化学修饰，再利用酶蛋白分子中可以进行结合的-NH、-OH、-SH、-COOH等活性基团与电极表面上的反应基团之间形成共价键连接。此法制备的酶电极响应速度快、稳定性好，酶与载体之间的连接很牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，利于连续使用。但由于采用了比较激烈的反应条件，从而不能得到比活力高的固定化酶。包埋法是指将聚合物的单体和酶溶液混合后，借助聚合促进剂(包括交联剂)的作用使单体进行聚合，从而将酶包埋于聚合物中的固定化方法。此法对大分子底物不适用，且储存稳定性和热稳定性差。交联法即利用双功能或多功能试剂在酶分子之间或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶。此法操作简便，但酶回收率不高。

静电纺丝技术是一种应用高压电使带电荷的高分子溶液或熔体在静电场中流动或变形，然后由于溶剂蒸发或熔体冷却而固化，最终产生直径数十纳米到几十毫米的均匀纤维的过程。静电纺丝纳米纤维膜由于具有大的比表面积、高孔隙率和高吸附性能而被认为是一种较为理想的酶固定化载体。迄今为止，两种主要的方法被用于通过静电纺丝将酶和聚合物形成纳米纤维。一种方法是将酶后固定在电纺纳米纤维的表面。另一种方法是直接将酶与不同聚合物溶液进行混合，一同进行静电纺丝，即本发明中所涉及的原位电纺。这种方法可以使保护酶分子免受极端条件限制的纤维内部空间的优势得到充分发挥，从而提高酶活。通过原位静电纺丝的方法固定化漆酶构筑生物传感器用于污染物的检测尚未见文献报道。因此，通过原位静电纺丝的方法制备固定有酶的超细纤维在生物传感器的制备方面将有很现实的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过静电纺丝技术直接将漆酶固定于电极表面从而能高效、稳定检测环境中氯酚类物质的方法。本发明所提供的酶电极的制备方法条件温和，简单易行，稳定性好，特别利于快速安置，并且运用此法制备的漆酶电极对氯酚类物质的检测具有灵敏、稳定、准确的优点。

1.本发明的第一方面，涉及一种静电纺丝固定化酶电极的制备方法，具体包括下列步骤：

1)电极的预处理：

玻碳电极表面先经金刚砂纸粗研细磨后，再用粒径0.05μm的α-Al₂O₃粉在平板玻璃上进行抛光，每次抛光后先洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次2～3min，重复三次，直至清洗干净；最后用乙醇、V_硝酸∶V_水为1∶1的硝酸和水彻底洗涤，得到新鲜的电极表面，而后置于0.2mol/L H₂SO₄中经循环伏安扫描至稳定；

2)原料溶液的配制：