[发明专利]一种抗诺龙的特异性抗体

权利要求书

1.诺龙的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为

的17β-NT半抗原与BSA蛋白连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大白兔，取血，分离出抗血清纯化制得抗体；

2.权利要求1所述的诺龙人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

(1)诺龙半抗原的合成步骤

精确称取0.5488mg诺龙溶于13.5mL无水四氢呋喃中，加入0.4g丁二酸酐，0.55mL三乙胺和0.243mg DMAP，60℃反应过夜，将溶剂悬蒸至干；

(2)半抗原的纯化

将所得残渣用有机溶剂乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)溶解后，过层析柱纯化。经过优化，最终选择乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)为展开剂。将得到的滤液旋蒸后得到白色晶体，即为17β-NT半抗原；

(3)人工抗原的合成

分别精确称取上述所得17β-NT半抗原0.025mmol(9.36mg)和9.3mg EDC，溶于1mLN-N二甲基甲酰胺(DMF)溶液中。将此溶液在冰浴中逐滴加入2mL浓度为5mg/mL的蛋白KLH溶液中(10mg KLH溶于2mL 130mmol/L碳酸氢钠缓冲液中，pH 8.1)，搅拌，室温下反应5h；再精确称取4.7mg EDC加入反应液中，搅拌，4℃反应过夜，然后将反应液在4℃、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中透析三天，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度加入叠氮钠，分装，-20℃保存；

3.权利要求1所述的诺龙酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

权利2所得的17β-NT半抗原与HRP结合制成酶标抗原。方法与免疫抗原的制备方法相同：分别精确称取上述所得17β-NT半抗原0.025mmol(9.36mg)和9.3mg EDC，溶于1mLN-N二甲基甲酰胺(DMF)溶液中。将此溶液在冰浴中逐滴加入2mL浓度为5mg/mL的HRP溶液中(10mg HRP溶于2mL 130mmol/L碳酸氢钠缓冲液中，pH 8.1)，搅拌，室温下反应5h；再精确称取4.7mg EDC加入反应液中，搅拌，4℃反应过夜，然后将反应液在4℃、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中透析三天，然后精确量取酶标抗原溶液的体积，测定浓度加入硫柳汞，4℃保存；

4.权利要求1所述的诺龙抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

免疫动物选用雌性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月进行第五次免疫，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：

初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；

加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗诺龙的特异性抗体。