[发明专利]用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法，其特征在于包括下列步骤：

1)器具、材料的准备，包括：

①细胞培养旋转瓶：垂直旋转瓶和水平旋转瓶，容量为10-10000ml，转速为1-500转/分；

②微载体：其材料由一种或多种可生物降解材料构成，或由非生物降解材料构成，或由可生物降解与非生物降解材料构成；

③细胞：包括哺乳动物毛囊干细胞和人毛囊干细胞；

④培养液：包括DMEM、DMM-F12、EGM、KGM、IMDM、MEM、EBM，其中添加一种或两种及以上生物因子；

⑤细胞培养箱：CO₂孵箱。

2)毛囊干细胞的培养，包括：

①将通过蛋白酶消化毛囊或毛囊组织块培养法而获得的人毛囊干细胞，以1X10³-1X10⁹细胞/克微载体的密度，接种在微载体上，悬浮于培养液中；

②将微载体连同种植在其上的细胞一起，转移到细胞培养旋转瓶中；

③依据细胞培养旋转瓶的容积，添加培养液至50-1000ml；

④将细胞培养旋转瓶置于细胞培养箱内培养，细胞培养旋转瓶的转动模式设置为：转动1-5分钟/小时，转速10-300转/分钟。培养箱的设置为：37℃、5％CO₂；

⑤待细胞在微载体上贴附生长接近单层时，利用0.25胰蛋白酶-0.02％EDTA，将细胞从微载体上消化下来，经血清灭活胰蛋白酶，磷酸盐缓冲液冲洗掉其中的血清和抗生素后，待用。

2.按权利要求1所述的用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法，其特征在于步骤1)中②所述的可生物降解材料为胶原蛋白、血液纤溶蛋白、明胶、透明质酸、多聚乳酸、多聚乙醇酸、聚亚胺脂、壳聚糖；所述的非生物降解材料为玻璃、硅胶、金属、塑料。

3.按权利要求1所述的用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法，其特征在于步骤1)中④所述的生物因子为IGF、bFGF、EGF、VEGF、磷酸盐维生素C、的塞米松、胰岛素、转铁蛋白、动物脑垂体提取物、青-链霉素、两性霉素、含有或不含有人或动物血清。

4.按权利要求3所述的用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法，其特征在于所述的动物血清来自牛、羊、马、猪或其它哺乳动物，可以是其中的一种，也可以是其中的两种或两种以上。