[发明专利]一种肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重PCR检测引物及方法，具体涉及一种肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物及方法。

背景技术

肠球菌院内感染在世界范围内发生。美国每年大约有200万人感染肠球菌，主要是住院病人感染，每年大约有88000人死于肠球菌感染，因肠球菌感染的花费大约在4.5亿美元；2005年英国就有7066人发生肠球菌菌血症，2004年增加了8％。与医院内感染不同，感染动物的肠球菌报道较少，但肠球菌可引起包括家畜、家禽、狗、猫和鸟广范围的感染，造成较大的经济损失。

AS(聚集物质)是质粒编码的能够介导供体菌和受体菌有效结合、有利于质粒转换的细菌黏附素，可增加细菌在肾小管上皮细胞和心内膜细胞的粘附，能增强肠上皮细胞的内化，并已被证明在心内膜炎的动物模型中增加心脏瓣膜赘生物的数量。cylA(溶细胞素A)编码激活因子A，该激活因子是溶血素cyl发挥致病作用所必须的。cyl能溶解真核细胞和原核细胞，在动物模型中已经证实溶细胞素可以显著促进心内膜炎和眼内炎的恶化，加强其感染的严重程度，同时也会加重人类肠球菌疾病的严重程度。Esp(肠球菌表面蛋白)有助于肠球菌的免疫逃逸，从而增强其致病力。在动物模型中，esp有助于粪肠球菌在泌尿生殖道感染中的集聚和繁殖生长。而肠球菌感染人和各种动物与这三种肠球菌主要的毒力因子有重要的关系。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物及方法。

本发明的技术方案是：一种肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物，它的序列如下：

肠球菌属引物的序列如下：

上游引物E1：5′-GTGTCGCTGATGGATGG-3′；

下游引物E2：5′-GCAAGCCGAACTGAGAGA-3′；

聚集物质引物的序列如下：

上游引物ASA 1：5′-GCTCGCTATTACGAACTATGA-3′；

下游引物ASA2：5′-TATGAAAGAACATCACCACGA-3′；

溶血素引物的序列如下：

上游引物cylA1：5′-ACACGGGGATTGATAGGC-3′；

下游引物cylA2：5′-GCAGCTAAAGCTGCGCTT-3′；

肠球菌表面蛋白引物的序列如下：

上游引物Esp1：5′-AGTTTTCATCTTTGATTCTTGG-3′；

下游引物Esp2：5′-AAATGATTCTTTAGCATCTGG-3′。

利用肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物检测肠球菌属的方法，包括提取样品的DNA后，用PCR反应体系和PCR反应程序对样品进行检测，

所述PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

2×PCR TaqMix                         10μl

引物E1/ASA1/cylA1/Esp1                4μl

引物E1/ASA1/cylA1/Esp1                4μl

模板DNA                               2μl

dd H₂O                                5μl

                                             

总体积                                25μl

所述PCR反应程序为：

95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min 10s，共30个循环；72℃终止10min。

本发明的有益效果是：本发明建立了一种快速准确鉴定肠球菌属及其主要毒力基因的多重PCR方法。本方法特异性高；敏感性实验表明该方法最低能检测到100pg DNA。为肠球菌感染的分子流行病学调查，研究肠球菌致病机制机制、早期预防提供了一种新的快速检测方法，同时构建的标准质粒也为未来建立实时荧光定量PCR方法提供了基础。