[发明专利]辅助鉴定甲型H3N2流感病毒耐药性的探针和引物对

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定甲型H3N2流感病毒耐药性的探针和引物对。

背景技术

一、甲型流感病毒和人类疾病

流感病毒属于正黏病毒科，分甲、乙、丙三种型别，甲型和乙型流感对人类威胁较大，其中甲型流感抗原变异频繁，可引起世界性大流行，对人类威胁最大。这类病毒所致疾病的临床表现为起病急、高热、肌痛、头痛伴有严重不适、干咳、咽喉痛，严重时可能导致人死亡，严重威胁人类健康。

二、甲型H3N2流感病毒的NA蛋白耐药突变的检测

抗流感病毒药物是治疗和缓解流感症状的有效措施，但流感病毒易发生变异，伴随抗流感病毒药物的广泛使用，耐药病毒株不断出现。我国上世纪末国内流感病毒尚未产生对烷胺类药物的耐药性，但2009年的调查则显示高达100％H3N2亚型已对烷胺类药物具有耐药性，H1N1亚型也接近50％。对于神经氨酸酶抑制剂类的抗流感病毒药物奥司他韦美欧等国的耐药性甲型H1N1流感病毒已接近100％，我国也接近70％。因此，虽然目前甲型H3N2流感病毒仍对奥司他韦敏感，但对甲型H3N2流感病毒的耐药情况进行监测显得尤为重要。

流感病毒突变的检测方法主要有普通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法等。实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)法可通过实时检测荧光信号直接得到检测结果，与普通RT-PCR方法相比，具有更为方便快捷，敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点，适用于对流感病毒进行高通量筛选。

三、实时荧光定量RT-PCR技术：

实时定量RT-PCR技术是近年来发展起来的一种PCR技术，它是在传统RT-PCR反应体系的基础上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时监测PCR反应进行的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板进行定量的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁琐，检测灵敏度低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点，可以在基因检测、基因表达、SNP分析等领域广泛应用。

探针是一类长度更为短小的Taqman探针，可检测单个核苷酸突变。增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定甲型H3N2流感病毒耐药性的探针和引物对。

本发明提供了一种辅助鉴定甲型H3N2流感病毒耐药性(检测针对甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上自氨基末端第292位氨基酸突变)的试剂，由探针和特异引物对组成；探针的核苷酸序列如序列表的序列1所示(R292K-P)；特异引物对为序列表的序列2所示DNA(R292K-F)和序列表的序列3所示DNA(R292K-R)组成的引物对。甲型H3N2流感病毒的NA蛋白见GENBANK ACCESSIONG NO.ABY25771.1(GI：162956720)。

所述探针可为TaqMan探针。所述探针可通过在所述DNA的5’末端连接荧光基团，3’末端连接淬灭剂得到。所述探针具体可通过在序列1所示DNA的5’末端连接FAM荧光基团，3’末端依次连接MGB淬灭剂和NFQ非荧光猝灭剂得到。其它荧光基团、淬灭剂及非荧光猝灭剂也可采用。

本发明还保护序列1、序列2和序列3所示DNA组成的DNA组合物。

本发明还保护序列1所示DNA的反向互补DNA、序列2所示DNA的反向互补DNA和序列3所示DNA的反向互补DNA组成的DNA组合物。

所述DNA组合物可用于制备用于辅助检测针对甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上第292位氨基酸突变的试剂盒。

所述DNA组合物可用于制备用于辅助鉴定甲型H3N2流感病毒耐药性的试剂盒。

本发明还保护序列表的序列1所示的DNA。

本发明还保护序列表的序列2所示的DNA和序列3所示的DNA组成的引物对。

用本发明的试剂(或DNA组合物)对待测样本进行RT-PCR，如果得到S型扩增曲线(结果为阳性)，即甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上第292位氨基酸为耐药突变，为耐药毒株，如果没有得到S型扩增曲线(结果为阴性)，即甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上第292位氨基酸为野生型，为野生不耐药的毒株。