[发明专利]一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种冰缘植物转化的方法，特别是涉及根癌农杆菌介导的高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法。

背景技术

高山离子芥是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、空气稀薄、辐射强、劲风。本实验采样地处于43.05N，86.49E的乌鲁木齐河源区流石碓，海拔3600～3900m。该地区年平均气温在-5～-7℃之间，6～8月平均气温为3.6℃，气温日差较大，是一种伴随反复冻融环境的高寒植物。利用生物技术手段，将外源基因导入高山离子芥悬浮胚性愈伤中，有利于研究冰缘植物的的各种生理生化过程。

目前，在高山离子芥一些抗冻、抗寒、耐盐等基因及其功能的研究中，都是将外源基因介入烟草、拟南芥中研究其功能。但是，并没有任何报道有将高山离子芥的抗性基因导入其自身中研究其基因功能，其主要的技术问题在于，尚未建立高山离子芥的转化体系。高山离子芥转化方法的建立，有助于研究高山离子芥自身特有的差异表达的基因、蛋白相互作用等，为研究高山冰缘植物提供了新方法，新思路，具有很好的应用前景。

近几年来，胚性愈伤作为转化的受体系统倍受关注，先后在柑橘、茶树、棉花、可可、苜蓿等作物上取得成功，但在高山离子芥中未见报到。1988年发现，该受体系统由于胚性细胞团中可增殖的胚性细胞处于表面及近表面，且能在众多的位点上形成体细胞胚，使转化方便而高效。另外，1993年Sato等人和1997年Trick等人(Sato S et al，Plant Cell Pep.，1993；Tricket al，Plant Tissue Cult Biotech，1997)分别发现在胚性细胞团增殖培养过程中，由于培养液与胚性细胞团充分接触，可进行高效筛选获得均一的转化胚性细胞团，进而获得大量转化的非嵌合的体细胞胚以再生转化植株。由于培养液与胚性细胞团充分接触，相对于在固体培养基上培养的愈伤组织，悬浮胚性愈伤大部分是游离的单细胞状态，更有利于高效的转入外源基因。我们借鉴胚性愈伤转化在其他作物上取得的成功经验，探索了一条利用高山离子芥悬浮胚性愈伤作为转化受体的转化途径。

高山离子芥是一种野生的药用高寒植物，具有极高的营养价值。悬浮胚性愈伤可以作为植物生物反应器，安全快捷地高效表达外源基因。利用生物技术手段，向高山离子芥基因组中导入外源基因，培育抗病，抗虫，抗干旱，抗冻等高品质的转基因高山离子芥新品种，有利于研究冰缘植物的各种生理生化过程，为冰缘植物的遗传改良工作提供了一条有效的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，通过建立一个适合多种外源基因转入高山离子芥基因组中悬浮胚性愈伤的转基因体系，该体系经GUS染色鉴定后，发现转化率高达80％左右，并利用高山离子芥悬浮胚性愈伤为转化受体，培育抗病，抗虫，抗干旱，抗冻等高品质的转基因高山离子芥新品种。

为实现上述目的本发明所采用的技术方案是：

一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，其步骤是：

(1)悬浮胚性愈伤的培养

选取颜色嫩黄活力旺盛的高山离子芥的愈伤组织块，置于三角瓶中的液体培养基中于摇床上，以120-130rpm的转速下悬浮培养，悬浮胚性愈伤液体基本培养基为MS，添加外源激素为6-BA、NAA和KT；6-BA的浓度为0.1-0.3mg/L，NAA的浓度为0.1-0.2mg/L，KT的浓度为0.2-0.3mg/L；液体培养基的PH为5.8-6.0；对三角瓶装有的悬浮胚性愈伤连续光照8-12小时，再连续黑暗12-16小时，温度为18-20℃。每隔6到9天继代一次；继代时悬浮胚性愈伤与新鲜培养基的体积比为1∶4，继代两次到三次以后，悬浮液中布满了大量体积均一的米黄色小胚，呈游离态的单细胞；

(2)菌株的活化及菌种的准备