[发明专利]运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域。具体地涉及一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法。 

背景技术

当前突出的全球性能源危机和环境污染问题，使得利用生物技术和可再生资源(生物质)进行燃料乙醇的工业化生产，成为包括美国、巴西、中国等在内的许多国家的重大研发项目之一。这些国家都在尝试开发新的可用于更直接、更全面高效利用生物质资源的燃料乙醇生产菌种和工艺。而运动发酵单胞菌乙醇发酵速度快、乙醇产率高(为理论值的97％，而酵母为理论值的90-92％)，能耐受高糖浓度和高醇浓度，是目前所知产醇能力最强的细菌之一，成为极具开发潜力的乙醇生产菌种；运动发酵单胞菌还能高产果聚糖、葡萄糖酸、山梨醇等生物化工产品，极具工业利用价值。 

但运动发酵单胞菌所能利用的碳源范围太窄，仅限于葡萄糖、果糖和蔗糖。扩展它底物范围的改造工作已取得很大进展，2006年10月Dupont杜邦公司和Broin公司联合宣布了基于运动发酵单胞菌木糖利用工程菌株的农作物秸秆产醇的工艺，并先后建立了生物质乙醇生产示范厂和中试工厂。菌株ZM4(＝ATCC31821)和NCIMB11163的全基因组序列也分别于2005年、2009年发表公布(Seo JS，Chong H，Park HS，et al.The genome sequence of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4.Nature Biotechnology.2005；23：63-68.Vassili N.Kouvelis，Elizabeth Saunders，Thomas S.Brettin，et al.Complete Genome Sequence of the Ethanol Producer Zymomonas mobilis NCIMB 11163.Journal of Bacteriology，2009，191(22)：7140-7141.)。然而，运动发酵单胞菌的基础科学研究和遗传改造手段现状还远远不能满足应用研究的需要。运动发酵单胞菌遗传背景知识的相对缺乏、严格的限制修饰系统、广泛而多样的内源性质粒、广泛的抗性谱等等因素，使得对它的遗传操作手段至今仍然有限而不成熟。 

目前导入外源基因和进行基因组DNA修饰(或染色体遗传操作)是通过接合转移和转化(化学法、电穿孔法)进行的。接合转移工作早在二十世纪八十年代就开展了，但接合转移效率因菌株和质粒差别很大，总体上是低的。化学法转化报道很少，因效率低和难以重复而极少使用。电穿孔方法则方便、简单、相对稳定，因而使用相对广泛。一些宽宿主质粒载体和人为构建的大肠杆菌-运动发酵单胞菌穿梭质粒载体被电穿孔转化到不同的运动发酵单胞菌菌株中，并能稳定复制存在。这些不带目的基因的质粒载体的电穿孔转化效率与宿主菌株、质粒类型和具体的操作条件、方法均直接相关，报道的转化效率从10¹个/μg DNA到10⁶个/μg DNA不等，而分析其操作条件、手法，则彼此差别又很大。 

一般来说，质粒越大，转化效率越低。带有目的基因的可复制质粒的转化，较前述不带 目的基因的可复制质粒的转化，要困难得多，所公开的信息也少得多，目前仅有个别的转化效率的数据报道。 

对运动发酵单胞菌进行基因组DNA修饰(或染色体遗传操作)时常规采用的基于宿主自身recA系统、通过长同源臂的同源重组定点整合方式，或者是通过转座子元件进行的随机转座方式，均首先需将相关质粒或DNA分子，经过电穿孔和(或)接合转移的方式，从胞外转移至胞内；而质粒或DNA分子进入细胞后的整合、转座过程，均属于稀有事件，因此基因组DNA修饰(或染色体遗传操作)，客观上更需要有高效、稳定、重复性好的电穿孔转化方法。而目前这方面的信息更是十分有限的。 

综上所述，目前的电穿孔转化方法，都是针对特定菌株和特定质粒的特殊应用，难以推广到其它菌株和质粒，相对缺乏通用性和稳定性、重复性，难以满足运动发酵单胞菌分子生物学研究和进一步的改造应用研究的需要，本领域需要建立更加通用、高效、稳定的电穿孔方法。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种快速优化、适应面广、稳定的、高效的运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法。 

本发明的技术方案概述如下：