[发明专利]可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物工程技术，特别是表达和制备可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的方法。 

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)，亦称凋亡素2配体(Apo2ligand，Apo2L)。TRAIL是继TNF和FasL之后被发现的第三个肿瘤坏死因子超家族的成员。人的TRAIL基因定位于染色体3q26，全长1769bp，编码281个氨基酸，蛋白相对分子质量为32.5kd，等电点为7.63，其中241个氨基酸位于胞膜外侧，称作可溶性TRAIL片段，功能部位为119-241位氨基酸。膜结合型TRAIL和可溶性TRAIL蛋白在体外均能诱导多种肿瘤细胞凋亡，正常组织对TRAIL蛋白均不敏感。鉴于TRAIL蛋白在肿瘤治疗中的潜在应用价值，人们试图将TRAIL蛋白可溶性片段开发成一种新的抗肿瘤药物。为获取较高纯度的TRAIL蛋白，人们尝试在各种真核或原核表达系统中表达TRAIL蛋白，并带上不同的标签便于纯化。在酵母等真核生物中表达，虽可获得一定量的TRAIL蛋白，但成本较高且容易造成TRAIL蛋白的基团修饰；在大肠杆菌等原核生物中表达，由于过量表达造成蛋白折迭不正常形成包涵体，可溶性蛋白产量很低。包涵体虽可通过变性复性工艺获得复性的TRAIL蛋白，但仅适用于抗体制备而不适宜用作抗肿瘤药物。另外，带有标签的重组TRAIL蛋白虽有利于蛋白的纯化，但最新的研究发现，修饰或加上标鉴可改变TRAIL蛋白的生物学活性和功能，如带His-标签的重组TRAIL蛋白不仅作用于肿瘤细胞而且作用于正常细胞。因此，无论对于开展TRAIL蛋白抗肿癌功能或机理的研究还是开发抗肿瘤药物，制备未修饰、不带任何标签的天然TRAIL蛋白或截短的TRAIL蛋白尤为重要 

发明内容

本发明提出了一种在大肠杆菌中高效表达可溶性TRAIL蛋白活性片段的方法和纯化制备技术。根据细菌遗传密码的偏好性人工合成编码截短的人TRAIL蛋白的DNA，插入通用的表达载体，并利用通用的大肠杆菌作宿主在17℃以下低温表达的技术思路，在大肠杆菌细胞内实现了截短的天然人TRAIL蛋白高效表达，克服了常规截短的天然人TRAIL蛋白高效表达时形成大量的不溶性包涵体问题。同时建立了三步法纯化的蛋白制备技术，成功纯化出高纯度的天然可溶性人TRAIL蛋白。 

本发明是这样实现的。具体操作步骤为： 

A、人工合成编码截短的人TRAIL蛋白的DNA。人工合成24种DNA单链片段。根据Genebank发表的人TRAIL可溶性蛋白的氨基酸序列，按细菌遗传密码的偏好性设计24种寡聚DNA单链片段，并人工合成全部24种DNA单链片段。该片段为12种正链片段，12种负链片段，每种DNA片段约45个核苷酸长，每一片段与相邻片段之间具有8-10个核苷酸的重叠且能相互配对。 

B、三轮PCR合成完整的双链DNA片段。将24种DNA单链片段分成2-3组，每组50μl的体系中加入浓度为10μM的每种寡聚DNA单链片段1.5μl、10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、Taq DNA聚合酶0.4μl，并补加ddH₂O至50μl，进行第一轮PCR。在PCR仪上94℃变性、52℃复性、72℃延伸，共扩增20个循环。使用PCR清洁试剂盒对PCR产物进行回收。每组取2μl第一轮回收的PCR产物，加入10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、Taq DNA聚合酶0.2μl，并补加ddH₂O至50μl并进行第二轮PCR。在PCR仪上94℃变性、52℃复性、72℃延伸，扩增30个循环。使用PCR清洁试剂盒对PCR产物进行回收。每组取2.5μl第二轮回收的PCR产物，加入10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs4μl、带限制性内切酶位点的5’-和3’-端引物各1.5μl、Taq DNA聚合酶0.4μl，并补加ddH₂O至50μl进行第三轮PCR。在PCR仪上94℃变性、52℃复性、72℃延伸，扩增30个循环。使用PCR清洁试剂盒回收PCR产物，得到全长完整的双链DNA片段。