[发明专利]一种提取连翘叶片DNA的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及医药，特别是一种提取连翘叶片DNA的方法。

二、背景技术

连翘(Forsythia suspensa(Thunb.)Vah1)为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)多年生落叶灌木，果实初熟尚带绿色时采收称为青翘，果实熟透颜色发黄时采收称为老翘，具有清热解毒、消肿散结之功效。

随着分子生物学的发展，目前DNA标记技术已经渗透到中药的各个领域，而DNA提取技术是分子标记技术的关键。连翘叶片内含有较多的酚类、鞣质类物质，这些次生代谢物的存在严重影响了DNA的纯度，进而影响到其后续的DNA扩增工作。因而连翘DNA的提取是分子标记技术应用其研究中的重中之重。

电泳检测表明经典的CTAB法提取出来的DNA含有少量的蛋白，并且DNA条带弥散，A_260/280＝1.38，所提取DNA中因纯度低，连翘叶片内含有过多的酚类、鞣质等杂质，对其后续分子标记技术的研究造成很大的影响，因此很有必要对连翘DNA提取方法进行改进。

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种提取连翘叶片DNA的方法，可有效克服连翘DNA的含有少量的蛋白，并且DNA条带弥散，A_260/280＝1.38，并消除连翘叶片内过多的酚类、鞣质等杂质对连翘DNA影响造成的纯度低问题。

本发明解决的技术方案是，以连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末(必要时，在加液氮之前，可先在研钵中加入0.05gPVP)，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入0-4℃预冷的提取缓冲液I，提取缓冲液I加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6-10倍，(所说的重量体积为连翘幼嫩叶片以重量g计，提取缓冲液I以体积ml计，以下同)，连翘幼嫩叶片加液氮迅速研磨成的粉末与提取缓冲液I混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，得离心后的沉淀物，沉淀物中加入提取缓冲液II，提取缓冲液II加入量为原连翘幼嫩叶片重量体积的6倍，沉淀物与提取缓冲液II混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，立即加入预热的2×CTAB和β-巯基乙醇，2×CTAB加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6-10倍，β-巯基乙醇加入量为每0.5g连翘幼嫩叶片原材料加入60-120μL，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次；水浴后，4℃下离心10min；取上清液置灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24∶1，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下离心10min，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置过夜(8-12小时)；4℃下离心5min，收集沉淀，弃去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀2-3次，每次用量为连翘幼嫩叶片原材料重量体积的2倍，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；每0.5g连翘幼嫩叶片原材料制得的风干物用50-60μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL 5-10mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA；

所说的提取缓冲液I是由0.25mol/L Tris-HCl、50mmol/L EDTA、0.25mol/LNaCl和余量为水混合均匀制成；所说的提取缓冲液II是由100mmol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.025mol/L Na₂B₄O₇和余量为水混合均匀制成。

本发明有效用于提取连翘叶片DNA，提出物纯度高，效率高，有效克服了电泳检测表明经典的CTAB法提取出来的DNA含有少量的蛋白，并且DNA条带弥散，A_260/280＝1.38，所提取DNA纯度较低的问题，有效保证了对其后续分子标记技术的研究创造了良好的技术条件，是提取连翘叶片DNA的方法的一大创造。

四、具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在实施中，具体可由以下步骤实现：