[发明专利]表达载体、重组质粒及它们的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有小鼠Musashi1基因启动子和报告基因的表达载体、含有该表达载体的重组质粒以及他们在细胞生物学中的应用。

背景技术

Musashi蛋白是一种高度保守的RNA结合蛋白，最早在果蝇体内发现，并被证明是果蝇神经干细胞的标志之一，大量表达在神经系统中。现已知Musashi是果蝇神经干细胞不对称分裂的关键调节子，它促使干细胞分裂后，一个细胞保留自我更新能力，另一个细胞具有进一步分化能力，因而被认为在干细胞状态的维持、干细胞分化和肿瘤形成中扮演重要角色。Musashi1基因是其在小鼠的同类基因，在胚胎阶段Musashi1选择性在神经前体细胞高表达，在成体神经干细胞中同样可以检测到Musashi1基因表达。随后研究表明Musashi1在神经干细胞的干性保持和分化中有关键作用，因此Musashi1被认为是小鼠神经干细胞的标志之一。

小肠黏膜是除中枢神经系统外另一个高表达Musashi1的组织，提示了Musashi1基因和肠上皮细胞的关系密切。肠黏膜上皮由无数单层柱状上皮组成，肠黏膜上皮细胞终身不断快速自我更新，更新周期平均4-6天。因为肠黏膜上皮的快速更新，很早就已经有人推测肠道上皮干细胞的存在。目前认为小肠上皮干细胞位于小肠隐窝的基底部，距隐窝底部2-7个细胞的位置，每个隐窝大约有4-6个；结肠上皮干细胞位于结肠腺体的基底部，每个隐窝大约有1-4个。肠上皮干细胞持续增殖、分化，并向绒毛顶端迁移(潘氏细胞向下迁移)，逐渐取代外层终末分化黏膜上皮细胞，迁移到绒毛顶端的外层细胞凋亡脱落落入肠腔，而外层细胞的死亡脱落与干细胞的分裂之间又维持一定的平衡。

虽然肠上皮干细胞的存在得到研究者的共识，但是肠上皮干细胞的标志的研究却进展不大。2003年，Nishimura等发现正常的人结肠标本的结肠隐窝Musashi1阳性表达区域位于隐窝的基底部，与肠上皮干细胞的位置一致。在成年小鼠小肠隐窝，Musashi1表达于潘氏细胞之上并紧连于潘氏细胞的几个细胞，Musashi1阳性细胞在肠上皮隐窝的普遍表达以及合适的数目都暗示Musashi1阳性细胞是小肠黏膜上皮干细胞或者祖细胞。肠上皮干细胞在Musashi1基因作用下，一个细胞维持干细胞性质，停留于肠上皮干细胞的位置，分裂产生的另一个细胞作为肠上皮的前体细胞-短暂扩增细胞，这些短暂扩增细胞继续增殖并逐渐分化，产生潘氏细胞、吸收上皮细胞、神经内分泌细胞和杯状细胞。通过对信号通路的研究，研究者发现作为一种转录抑制因子，Musashi1调节Notch信号，最终调节Hairy and enhancer of split 1(Hes1)基因的表达，这种调节最终影响到杯状细胞、内分泌细胞、潘氏细胞的形成，暗示Musashi1和Hes1的共表达细胞可能就是肠上皮干细胞。

新近的一些研究虽然使研究者对Musashi1基因作为肠上皮干细胞的标志提出疑问，并报道了leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 (Lgr5)、Acheate-scute like 2(ASCL-2)、Doublecortin and CaM kinase-like-1(DCAMK-1)等候选肠上皮干细胞的标志基因，但是无论是Lgr5还是ASCL-2，都不是仅局限表达于肠黏膜上皮，在其它组织中均有发现，这些新的候选基因也没有得到基因敲除实验的支持。作为较早作为候选肠上皮干细胞的标志基因，Musashi1仍然是肠上皮干细胞或者祖细胞的候选基因之一。Musashi1阳性细胞新出现的部位是位于潘氏细胞间，且多呈长柱状，这些细胞本身就是另一些新出现的候选肠上皮干细胞标志基因(例如Lgr5)的阳性部位，并且也有研究者认为肠上皮干细胞是位于潘氏细胞之间的长柱状细胞。因此，Musashi1基因仍可以作为肠上皮干细胞或者至少是祖细胞的候选标志基因。