[发明专利]丹参羟基肉桂酰转移酶基因序列和编码的氨基酸序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于药用植物基因工程技术领域，具体涉及一条丹参羟基肉桂酰转移酶基因序列、编码产物及其在丹参水溶性活性成分合成中的应用。 

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科多年生草本植物，在中国及其它亚洲国家广泛种植。根入药，在临床上可用于心脑血管疾病，癌症及各种炎症的治疗。丹参位居我国“十大”大宗药材之首，其年需求量近2.4万吨，销售价格近年来一直维持在10元/千克左右，仅药材生产销售近2.3亿元，以丹参为主要原料制成的中成药其产值超过100亿元，具有广阔的开发利用前景。 

近年来，伴随着丹参药材需求的日益扩大和野生资源的逐渐减少，提高丹参药材活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参资源开发中亟待解决的关键问题之一。丹参的活性物质分为两大类：一类为水溶性的酚酸类物质，包括咖啡酸、丹参素、迷迭香酸、丹酚酸、紫草酸等；另一类为脂溶性的丹参酮类物质，包括丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮等，属于二萜醌类化合物。其中，丹参水溶性活性成分因其与传统中药以水煎服的用药方式相一致越来越受到人们的重视。 

利用基因工程技术对植物代谢途径的遗传特性进行改造，改良植物性状及品质，培育能够大量积累目标次生代谢物的植物品种，愈来愈受到人们的关注。而了解目标产物的生物合成途径及其调控方式是利用植物基因工程提高目标产物积累、改良植物品质的前提。因此，挖掘丹参的基因资源、筛选丹参的重要功能基因，对丹参次生代谢物质的调控、分子育种及品质成因等研究等具有重要的意义。 

迷迭香酸是丹参主要的水溶性成分之一，也是一些复杂酚酸类化合物的核心组成单位，丹酚酸和紫草酸等均是由迷迭香酸衍生而来的。目前对迷迭香酸的生物合成途径研究较多，对丹参的同科植物紫苏的研究结果显示，苯丙烷类代谢途径和酪氨酸代谢途径共同参与了迷迭香酸的合成。酪氨酸代谢途径中的酪氨酸氨基转移酶(TAT)和羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)，苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和4-香豆素辅酶A连接酶(4CL)以及迷迭香酸合酶(RAS)均在迷迭香酸的生物合成中发挥重要的作用。尽管越来越多的迷迭香酸合成相关基因从丹参中克隆，但仍有一些酶基因和调控基因的序列尚无报道。 

酰基化作为一类重要的修饰方式对植物次生代谢物的多样性形成具有重要的意义。羟基肉桂酰转移酶主要参与酚酸类物质的生物合成，属于BAHD酰基转移酶家族。目前羟基肉桂酰转移酶基因在烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、毛果杨(Populus trichocarpa)等多数植物中均有报道，但至今尚无药用植物丹参中羟基肉桂酰转移酶基因序列及其功能的文献报道。 

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种丹参羟基肉桂酰转移酶基因序列。 

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种丹参羟基肉桂酰转移酶基因编码的氨基酸序列。 

本发明所要解决的还有一个技术问题在于提供一种丹参羟基肉桂酰转移酶基因的用途。 

解决上述技术问题采用的技术方案是：它具有SEQ No.1所示的核苷酸序列。 

在本发明的SEQ No.1所示的核苷酸序列中，包含一个长度为1284个碱基的开放读码框，位于第23-1306位核苷酸。 

丹参羟基肉桂酰转移酶基因的克隆方法步骤如下： 

1、提取核酸 

取丹参种子在盛有蛭石与草木灰的质量比为3∶1的基质中萌发，在光照强度为2000lx、相对湿度为80％的光照培养箱内，16小时光照、8小时黑暗交替培养，种子萌发并长出第一对真叶后移栽至营养钵中，营养钵中的培养条件与萌发的条件相同，每隔3天浇灌一次水，培养60天的丹参幼苗提取DNA、RNA。 

丹参总DNA的提取采用OMEGA公司的E.Z.N.A.^TM Plant DNA试剂盒，丹参总RNA的提取采用OMEGA公司的E.Z.N.A.^TM Plant RNA试剂盒，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA、RNA的质量，用分光光度计测定DNA、RNA的含量。 

2.克隆基因全长 

采用RT-PCR和DNA步移方法进行基因全长的克隆。分三个阶段进行： 

(1)用RT-PCR克隆羟基肉桂酰转移酶基因片段