[发明专利]肝炎病毒体外培养模型及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及体外培养模型及其构建方法与应用，尤其是肝炎病毒体外培养模型及其构建方法与应用。

背景技术

众所周知，乙型肝炎病毒(HBV)是引起肝脏疾病的最主要原因之一，全球大约有3.5亿人是慢性HBV携带者，严重的可导致肝硬化、原发性肝癌。病毒性乙型肝炎流行面广，传染性强，是世界上最常见的感染性疾病之一，人一旦被乙肝病毒感染，肝脏就会发生炎性病变，肝细胞受损，对人体造成极大的危害，因此研究HBV的发病机制及其防治方法具有重要的意义。

研究HBV生物学特性、乙型肝炎发病机制、体外抗HBV药物筛选及其防治方法的重要环节之一就是要建立方便有效的HBV体内外培养模型。现在用于研究HBV的动物培养体内模型，主要有灵长类、树鼩、鸭和应用最多的转基因小鼠模型及人鼠嵌合肝模型；建立模型的细胞包括成人肝细胞、胎肝细胞、HepRG细胞系及以HepG-2为基础的转基因细胞。动物模型虽然能模拟体内HBV感染过程，但是仍存在HBV复制表达水平不高，种间差异及免疫缺陷等问题。而建立的细胞培养体外模型，由于均存在不同程度的局限性，因而仍然没有合适理想的模型，如成人肝细胞是一类终末分化的细胞，不能传代培养，且在肝细胞铺板后，成熟肝细胞的功能如白蛋白产生能力下降、失去典型多角形态，对病毒敏感性也逐渐下降，因此限制其实际应用；胎肝细胞也终究因为不能传代培养而在应用中受到制约；HepRG细胞系模型不仅不能获得完整的HBV颗粒，而且难以去除添加物对HBV感染过程的可能影响；而在目前应用最广的以HepG-2为基础的HepG2.2.15转基因细胞中，由于HBV整合在宿主细胞染色体上且不能被清除，因而其复制方式与自然感染不同，细胞培养中不产生cccDNA(复制中间体)，病毒复制水平低，另外，HBV与转染肝癌细胞长期稳定的整合状态难以用于研究细胞的转化机制。

此外，人们还探讨了HBV感染的非肝源性细胞，并且，越来越多的研究表明，HBV不仅感染肝源性细胞，也可以感染其它如骨髓干细胞、内皮祖细胞、胎盘滋养层细胞等具干细胞特性的细胞，但是，由于HBV不能或很难在这些细胞中复制繁殖，且这些细胞为非肝脏源细胞，HBV感染机制可能不同，因此仍然不能用于建立理想的细胞培养模型。

丙型肝炎病毒(HCV)也呈全球性流行，根据世界卫生组织的统计，HCV在人群中的感染率约为3％，全球约有1.7亿人感染HCV，每年新发病型肝炎病例约3.5万例。我国进行的全国HCV血清流行病学调查显示，我国一般人群抗HCV阳性率为3.2％，约有4000万人感染HCV。HCV是引起人类慢性肝炎和输血后肝炎的主要病原体之一，约60％的急性丙型肝炎患者转化为慢性，而慢性患者中分别有8-46％和11-19％发展成肝硬化和肝细胞癌。

由于HCV在被感染组织和血清中浓度较低，HCV的高度变异，缺乏稳定的HCV体外细胞培养系统及理想的实验动物模型等问题，阻碍了对HCV的进一步研究。除人之外，黑猩猩是目前报道的唯一可以感染HCV的实验动物，由于来源不便，耗资巨大，使其应用受到限制。

到目前为止，以干扰素为主的抗病毒治疗只能使30％左右的患者得到根治，尚未发现令人满意的治疗药物和有效疫苗。因此，迫切需要寻找预防和治疗HCV感染的有效方法。而其关键是建立稳定的维持病毒复制和传代的细胞模型，以深入了解丙肝病毒的生命周期和发病机理。

HCV体外细胞培养模型研究现状是：1肝源细胞模型，即包括原代肝细胞、胎肝细胞，但因为其复制水平低，也不稳定，不能满足药物筛选研究的要求；肝癌细胞系则不能用于感染机制的研究。2HCV基因组转染模型：包括Huh-7细胞转染HCV JFH-1 RNA、胎肝细胞转染无适应性突变的HCV RNA但缺陷在于仅HCV 2a、1a型可传代培养，细胞培养所分泌的病毒颗粒较之动物实验高同质性和低感染性。3肝外细胞模型包括人淋巴细胞、纤维母细胞、单核白血病细胞、胆管癌细胞、T细胞系、PBMC但病毒感染非肝细胞的方式和途径是否与体内感染肝细胞相似，且在非肝细胞中长期培养的HCV，其生物学特性是否发生改变迄今尚不清楚。