[发明专利]禾谷镰孢菌对多菌灵的中等抗性水平菌株的分子检测方法

说明书

一、技术领域

本发明属于一种禾谷镰孢菌对多菌灵的中等抗药性水平菌株的分子检测方法，可用于监测苯并咪唑类杀菌剂(多菌灵)抗性禾谷镰孢菌群体发展动态，进行抗药性小麦赤霉病的流行预测。 

二、技术背景

小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌Fusarium graminearum Schwabe引起的一种世界性病害，严重影响小麦的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、硫菌灵等。作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，他们也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，多年使用后许多植物病原真菌群体中出现了抗药性优势生理小种，使药剂防治效果下降或完全失去效果。经过10多年的研究，南京农业大学杀菌剂实验室发现小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由于禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因(FGSG_06611.3)突变造成，该基因编码第167位和第200位氨基酸密码子的突变分别为TTT(Phe)→TAT(Tyr)和TTC(Phe)→TAC(Tyr)。第167位或者第200位氨基酸密码子的突变均可引起禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗药性的产生，其中第167位突变占所有抗药性突变类型总量的97％以上。成为病原菌产生田间抗药性的主要原因。 

由于病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3％～5％时，即可引起抗药性病害流行，使药剂防治失败。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的效应鉴别抗药性。本发明在抗药性机制研究基础上，根据基因点突变类型应用PIRA-PCR技术检测病原真菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性，则能快速、准确检测样本。PIRA-PCR技术较等位基因特异性PCR(ASO-PCR)更为准确，不会有假阳性结果。它具有(1)快速、准确检测出禾谷镰孢菌群体中的中等抗性菌株；(2)准确鉴定菌株的抗药性基因型；(3)耗时短，仅需5～8小时。 

三、发明内容

技术问题 本发明的目的在于提供禾谷镰孢菌对多菌灵产生中抗水平菌株一种快速诊断和检测方法。现有技术首次利用PIRA-PCR，根据抗性菌株发生突变的特点，结合了巢式PCR技术成功实现了快速、准确地对小麦赤霉病菌抗多菌灵中抗群体的分子检测，检测准确率达到95％以上，对及时采取有效措施控制当季抗药性病害流行，具有实用价值。 

技术方案 禾谷镰孢菌抗多菌灵的中抗菌株β₂-微管蛋白基因(FGSG_06611.3)，其第167位氨基酸密码子发生点突变TTT(Phe)→TAT(Tyr)或第200位氨基酸密码子发生点突变TTC(Phe)→TAC(Tyr)。 

一种禾谷镰孢菌对多菌灵产生中抗水平菌株检测方法，共分三步： 

第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取待测样品的核基因组DNA。 

第二步：运用内外引物对，进行巢式PCR反应，获得164bp的目标片段。 

用于PIRA-PCR技术引物具有特异性，该引物对能为β₂-微管蛋白167位未突变菌株人为引入HindIII酶切识别位点；巢式PCR技术的设计用于提高反应效率。设计的依据是抗药性菌株在β₂-微管蛋白第167位由Phe(TTT)→Tyr(TAT)，200位由Phe(TTC)→Tyr(TAC)。 

①扩增禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因片断的外引物对 

上游引物NoF 5′-AAGCCATTGATGTTGTTCG-3′ 

下游引物NoR 5′-CATGACGGTAGAAATCAGGTAG-3′ 

②扩增含人为引入错配碱基β₂-微管蛋白基因片段的内引物对 

上游引物Hind3F 5′-CGATCGCATAATGGC A CT-3′ 

下游引物Hind3R 5′-GGGTCCTCTCGTAGATATCGTACA-3′ 

巢式PCR反应体系及其扩增程序： 

(1)外引物扩增： 

反应体系： 

PCR buffer(10×)        2.5μL 

dNTP(2.5mM each)        2μL