[发明专利]一种玉米心叶特异性启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及植物启动子的克隆及其应用，具体涉及一种玉米心叶特异性启动子的克隆及其功能分析。

背景技术

玉米不仅是粮、饲兼用的主要作物，而且还是重要的工业原料。随着工业化的普及和加快，耕地面积的减少、环境的恶化和食物短缺的矛盾日益尖锐，而常规育种技术无法满足人类对玉米新品种高产优质、抗病抗逆的需求。十多年来，已经利用转基因技术培育出一批抗虫、抗病、抗除草剂、抗盐、抗旱、优质的玉米新品种。

玉米螟(即玉米钻心虫)是玉米的主要害虫之一，对玉米危害极大，可导致玉米减产10％以上。而由于玉米对玉米螟的内源抗性受多基因控制，常规育种方法不仅周期长，且抗性与高产负相关，抗瞑育种难度较大，20年间各国均未取得明显进展。

进入20世纪90年代，通过转基因方法将来源于苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因导入玉米以获得抗虫品种取得突破性进展，转Bt基因玉米抗虫效果明显，平均增产5-10％。然而转基因植物的安全性一直是人们关注的焦点，其中外源基因的表达有可能改变植物自身的代谢，从而带来目前不为人所知的潜在风险。

为了更安全、高效防治玉米螟，将外源基因表达对植物和环境的影响降到更低，在转基因载体中使用心叶特异表达基因的启动子代替组成型CaMV35S启动子驱动Bt毒蛋白的表达，不仅可以控制在幼嫩心叶中为害的第一代玉米螟初孵幼虫，而且可以将外源基因表达带来的潜在风险降到最低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米心叶特异性启动子，该启动子可驱动基因在玉米心叶中特异高表达。

本发明的技术方案如下：

一种玉米心叶特异性启动子，来源于玉米(Zea mays ssp.Mays L.)，具有如下a)或b)的核苷酸序列：

a)序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；

b)在严格条件下与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交，且具有相同功能的核苷酸序列。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No：1长1976bp。

含有本发明启动子的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明通过实时荧光定量PCR(real-time fluoresent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)技术进行分析，发现ZmPEP1基因在玉米幼嫩的心叶中特异性高表达，克隆该基因的启动子，命名为WS1-ZmPro，其序列如SEQ ID No：1所示。

本发明的启动子具有心叶组织特异性，可应用于转基因植物育种领域，通过构建含有该启动子的植物表达载体，将其转化到植物(例如玉米)中，驱动下游基因在植物心叶中特异性高表达，达到育种目的，例如驱动Bt毒蛋白的基因在玉米心叶中特异性高表达，从而获得安全、高效抗玉米螟的转基因玉米。

附图说明

图1显示了ZmPEP1基因在玉米各组织中的相对表达量。

具体实施方式

下面通过实施例，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。

本实施例通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)验证了ZmPEP1基因在玉米幼嫩心叶中的特异高表达，从而克隆出其启动子，该启动子长1976bp，序列见序列表中SEQ ID No：1。

一、材料

玉米(Zea mays ssp.Mays L.)，在26℃温室中生长4周，每天光照16小时，黑暗8小时。

二、总RNA的提取及cDNA合成

1、玉米各组织总RNA的提取

取4周龄玉米的根、茎以及心叶，分别在液氮中将2g新鲜洁净的玉米组织研磨为粉末，转移到1ml Trizol溶液(invitrogen公司)中，混匀，加入200μl氯仿，充分混匀，室温下静置2分钟，4℃、12000g离心15分钟，吸出上清，转移到新的eppendorf管中，加入500μl异丙醇，混匀，4℃、12000g离心10分钟，弃上清，加入1000μl 75％乙醇洗涤一次，弃上清，所得RNA沉淀溶于50μl DEPC-ddH₂O中。

2、cDNA合成