[发明专利]一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶及其表达

权利要求书

1.一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，其特征在于，其基因编码具有如下核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID No：1；

(2)序列表中的SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

(3)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述基因编码的葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，其特征在于，具有下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：2；

(2)序列表中的SEQ ID No：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述的细菌漆酶基因的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的宿主菌。

5.含有权利要求1所述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)以包含葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的BAC(细菌人工染色体载体(Bacterial Artificial Chromosome，)载体DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述引物为：

P1：5′-GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3′

P2：5′-CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3′

(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和pMD18-T质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因(bgl1A)的pMD18-T重组质粒；

(3)用Nde I和Xho I双酶切步骤(2)所得的pMD18-T重组质粒和pET22质粒，然后用T4连接酶将酶切后的bgl1A与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明bgl1A基因的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A。

6.葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于：

将根据权利1所述的核酸分子或根据权利3或5所述的载体转移到微生物宿主细胞中用于表达核酸分子，或利用根据权利4所述的表达宿主表达核酸分子；以及任选的从宿主细胞中分泌所表达的多肽。

E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A接种于含有氨苄青霉素的200ml LB液体培养基中，放置于37℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.6；加入终浓度为0.75mM的IPTG进行诱导，并于30℃、180rpm条件下继续培养5小时；4℃、8000g离心收集菌体，加入0.1倍菌液体积的Binding buffer，350W冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗酶液，所述粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化，得到高纯蛋白。