[发明专利]一种细菌漆酶基因及其表达与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说一种细菌漆酶及其表达，以及该细菌漆酶蛋白在工业上的应用。

背景技术

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物氧化，同时伴随有分子氧还原成水。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆和漂白、食品风味改良、饲料营养改善、人工合成染料脱色、纺织纤维软化细化、新型药物开发、生物传感器制造及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值，近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的一个热点。

漆酶广泛存在于高等真菌(特别是担子菌)中。近年来，部分真菌漆酶已经应用于工业生产，如Zylite等。然而，真菌漆酶受羟基离子的影响较大，在碱性条件下活性迅速降低，严重影响了其在工业中的应用。随着全基因组测序技术的迅速发展，人们发现，漆酶在细菌中同样广泛存在。细菌漆酶可以克服真菌漆酶的缺点，其在碱性条件下具有良好的催化活性并具有较高的稳定性。目前，已经在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物中发现漆酶，但被系统研究的细菌漆酶基因不超过20个，需要进一步开发与研究，且目前还没有细菌漆酶在工业方面应用的报道。

发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种细菌漆酶及其表达该细菌漆酶基因的工程菌株。

本发明的细菌漆酶，其原始来源于中国南海海洋海水未培养微生物，其基因编码，具有如下核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：1；

(2)序列表中的SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

(3)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸序列。

本发明的细菌漆酶，具有下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：2；

(2)序列表中的SEQ ID No：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

含有上述细菌漆酶基因的重组表达载体、宿主菌也是本发明的保护范围。

含有上述细菌漆酶基因的重组表达载体的构建方法，以包含细菌漆酶基因的BAC(Bacterial Artificial Chromosome)载体DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并与pMD18-T质粒连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有细菌漆酶基因(lac15)的pMD18-T重组质粒，用Nde I和Xho I双酶切所得的pMD18-T重组质粒和表达质粒载体，然后用T4连接酶将酶切后的lac15与表达质粒载体连接，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到含有本发明lac15基因的工程菌株；其中所述引物为：

P1：5′-CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3′

P2：5′-CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3′

上述构建方法中所述表达质粒载体指pCold、pET15、pET22或pET28等。

上述构建方法中所述宿主菌是指E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coli JM109或E.coli Rosetta等。

下面以表达质粒载体pET22b(+)、E.coli BL21(DE3)为例，具体介绍含有本发明细菌漆酶基因的重组表达菌株的构建方法，具体包括以下步骤：

(1)以包含细菌漆酶基因的BAC载体DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述引物为：

P1：5′-CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3′

P2：5′-CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3′

(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和pMD18-T质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有细菌漆酶基因(lac15)的pMD18-T重组质粒；