[发明专利]猪流感病毒和猪口蹄疫病毒的混合病毒样颗粒、制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及猪流感病毒和猪口蹄疫病毒的混合病毒样颗粒，以及制备和应用。

背景技术

猪流感是由猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的不同日龄、性别和品种猪只的一种急性、热性和高度接触性的呼吸道传染病，其临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭和死亡为特征。各年龄、性别、品种猪均能感染，发病率高。单独感染猪流感病毒可导致猪只生产性能下降，料肉比升高，增重减缓，给猪场造成一定的经济损失。更为严重的是，猪是禽、人、猪流感病毒重组和复制的“混合器”，猪流感病毒不需重组就有最大限度感染人的能力。而且早期的人流感病毒还可以储存于猪体内，并在一定时期内再次感染人。目前，常见的猪流感主要有H1N1、H1N2和H3N2等3种亚型。值得重视的是，SIV更多见与其它疫病，如猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、猪附红细胞体等并发或继发感染，使疫情变得反复而复杂，是现代集约化猪场普遍存在且难以根除的猪呼吸道传染病之一，对养猪业危害极大。

甲型H1N1流感病毒的流行不仅给很多国家的养殖业造成了巨大的经济损失，而且对世界范围内的人民公共卫生安全造成了一个很大的挑战。2009年4月爆发于墨西哥的甲型H1N1流感全球瞩目，随后，美国和加拿大等国也相继出现人感染H1N1猪流感的情况并有部分病人死亡。在短期内研制有效疫苗来预防甲型H1N1流感病毒抑制疫情传播和加重迫在眉睫。目前国内生产的用于禽畜预防流感病毒的疫苗大部份是采用传统的鸡胚法培养增殖活病毒，经化学试剂灭活后生产成疫苗。这种技术又分为两类不同的制备法：一是直接用野生型病毒感染鸡胚制备，另一类是先采用反向遗传技术改造野生病毒的遗传性，然后用“拯救”改造的新病毒来感染鸡胚，增殖病毒，生产疫苗。

这些流感疫苗制备技术有其优点，但亦存在着很大的缺陷。尤其是流感感毒的与众不同特性，例如：高频率突变，双重及多重亚型病毒之间遗传物质重组及抗原漂移等——使这些疫苗的长期安全性及有效性受到了极大挑战，甚至产生了“无效疫苗”，难以应付新的突变型H1N1流感病毒的传染。除此以外，这些疫苗制剂还存在着以下不足：

1、生产周期长：从获得新的亚型病毒株到疫苗生产上市，耗时5-8个月，难以遏制新的疫情大爆发。

2、生产条件高：为预防人为的污染环境及生产的活病毒的泄漏扩散，整套生产必须按规定在生物安全三级实验室条件下进行，病毒的灭活必须保证完全，彻底。

3、无法区别被免疫过的猪只与受病毒感染的猪只。

口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，主要感染偶蹄兽，人和非偶蹄动物也可感染。国际兽疫局将口蹄疫列为A类传染病之首，我国也把它列为家畜传染病的第一个病。口蹄疫一旦暴发会导致巨大的经济损失，同时也影响到国家和地区的正常贸易活动。由于口蹄疫直接威胁国际贸易和国家声誉及动物生态和人类食品卫生，因而受到人们的普遍关注。近年更被列为生物武器安全公约组织重点检查对象，世界各国包括无口蹄疫的国家，均对本病保持高度警惕，并大力开展病原学、诊断技术和防制技术的研究。

FMDV是已知的最小的动物RNA病毒，病毒粒子呈球形，正二十面体结构，直径20～30nm，分子量6.9×106u，沉降系数146s，在氯化铯中的浮密度为1.43g/mL。完整病毒含单股正链RNA和衣壳蛋白两部分，无囊膜。衣壳由VP1、VP2、VP3、VP4各60分子组成，基因组RNA由约8500个核苷酸组成，可直接作为信使RNA。FMDV只含有一个ORF(开放阅读框)，编码病毒的前体聚蛋白。前体聚蛋白经两次裂解后形成4种结构蛋白(VP1-VP4)，其中VP1(1D)基因位于基因组的2977～3615位，编码213个氨基酸。早期的研究表明，结构蛋白是诱导中和抗体的主要成分，它暴露在病毒粒子的表面。在已发现的O型五个抗原位点中，有三个位于VP1上，其中140-160位氨基酸处的G-H环是最主要的保护性抗原位点，空间构象比较复杂，具有较大的运动性，在其顶部形成了一个高度保守的Arg-Gly-Asp(RGD)序列，是FMDV的细胞受体位点。VP1的第140～160和200～213氨基酸残基是两个主要的B细胞表位，能诱导抗FMDV的中和抗体，VP1第141～160氨基酸残基中也含有至少一种T细胞表位，能诱导FMDV专一性的T细胞反应。